吳巧玉， 何天久

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 貴陽 550006)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬一年生草本植物，糧菜兼用，是僅次于小麥、稻谷和玉米的第四大糧食作物[1]。低溫霜凍是影響馬鈴薯生產(chǎn)的重要自然災(zāi)害之一，而馬鈴薯普通栽培種不耐霜凍，在氣溫低于7 ℃時(shí)停止生長，-1.5 ℃受凍害[2]。植物經(jīng)過非致死溫度的低溫處理可以獲得更強(qiáng)的抗寒能力，這種現(xiàn)象被稱為冷馴化[3]，植物冷馴化能力是一個(gè)的多基因性狀，涉及大量的基因相互作用[4]。

光合作用是一系列復(fù)雜的代謝反應(yīng)的總和，溫度是決定光合作用最關(guān)鍵的自然因素之一。Bilska等[5]研究表明，光合作用對(duì)低溫最為敏感。當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，植物葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，光合速率下降，從而導(dǎo)致植物光合作用下降[6]。Norman等[7]研究表明，光合作用為冷馴化過程提供了碳骨架和能量，從而抵御低溫脅迫。低溫脅迫也會(huì)影響活性氧清除系統(tǒng)和光合作用相關(guān)酶系活性，加速活性氧在植物葉綠體內(nèi)積累，影響D 1蛋白合成及周轉(zhuǎn)[8]。這些研究結(jié)果表明，光合作用在植物低溫脅迫中發(fā)揮了重要作用，因此研究冷馴化過程中一些光合作用相關(guān)蛋白有助于解析植物冷馴化能力涉及的代謝途徑。

目前關(guān)于馬鈴薯冷馴化能力的分子機(jī)制研究較少。前期對(duì)兩種馬鈴薯野生種冷馴化過程中蛋白組分析(數(shù)據(jù)待發(fā)表)發(fā)現(xiàn)，五種光合蛋白基因(葉綠體細(xì)胞色素f、葉綠體放氧增強(qiáng)蛋白1、葉綠體錳穩(wěn)定蛋白-Ⅱ、葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ修復(fù)蛋白PSB 27-H 1、葉綠體甘油醛-3-磷酸脫氫酶)在冷馴化期上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因與冷馴化能力相關(guān)。因此，本研究以馬鈴薯野生種S.acaule(W 3，抗凍、具冷馴化能力)和S.cardiophyllum(Cph 12,霜凍敏感、不具冷馴化能力)為研究對(duì)象，通過熒光定量PCR，研究這五種光合蛋白基因在冷馴化期間的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，以期闡明其在馬鈴薯冷馴化過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為馬鈴薯野生種W 3和Cph 12，均從國家馬鈴薯中心引進(jìn)。材料經(jīng)脫毒培養(yǎng)，試管苗種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚。在苗期(植株有5～7片完全展開的復(fù)葉)取長勢(shì)一致的植株，在人工氣候箱(AHRP-2000 D,常州)內(nèi)培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)條件為：溫度(20±0.5)℃、相對(duì)濕度(70±5)%、光/暗(14 h/10 h)培養(yǎng)、光照強(qiáng)度100 μmol·(m2·g)-1；隨后開始進(jìn)行冷馴化，馴化條件為：白天4 ℃14 h，光照強(qiáng)度100 μmol·(m2·g)-1；夜間2 ℃10 h，黑暗。在冷馴化第0、4、8、12天，分別取W 3和Cph 12整個(gè)植株用于抗凍性鑒定，并取葉片(從頂端往下第3、4片展開復(fù)葉)用于光合速率、葉綠素及qPCR檢測(cè)。

1.2 抗凍性鑒定

在冷馴化的0 d、4 d、8 d、12 d各取9株材料進(jìn)行抗凍性評(píng)價(jià)，所選材料在低溫人工氣候箱(PAX-250 C，常州)內(nèi)-5 ℃黑暗條件下處理3 h，隨后在20 ℃、光照強(qiáng)度100 μmol·(m2·g)-1條件下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行冷凍損傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用Wu等[9]的方法，具體標(biāo)準(zhǔn)為：0=沒有損傷；1=頂部葉片輕微傷害；2=頂部的一些葉片被凍死；3=所有頂部葉片凍死；4=所有葉片和小葉柄凍死；5=葉片和莖干凍死。計(jì)算各試驗(yàn)受損程度的傷害指數(shù)(DI)。

DI =(x 0+x 1+x 2+x 3+x 4+x 5)/處理總數(shù)，

式中，x 0～x 5代表不同損害等級(jí)的評(píng)估值之和。

1.3 葉綠素及光合測(cè)定

葉綠素采用葉綠素含量分析儀(SPAD-502，日本)測(cè)定展葉(由頂部往下第4片葉)葉綠素含量；光合速率采用LI-6400 XT便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)(LI-COR，美國)測(cè)定同一葉片的凈光合速率，測(cè)定時(shí)光照設(shè)定為800 μmol·(m2·s)-1。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)

在冷馴化的0 d、1 h、1 d、4 d、8 d與12 d取展葉(由頂部往下第4片葉)，液氮凍存，用于熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)量。RNA采用試劑盒(OMEGA，美國)抽提。cDNA反轉(zhuǎn)錄用試劑盒(GenStar，中國)進(jìn)行。熒光定量PCR試劑選用2×RealStar Green Fast Mixture(GenStar，中國)，儀器為BIO-RAD C 1000 Touch Thermal Cycle。PCR程序設(shè)置為95 ℃ 5 min,(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)40個(gè)循環(huán)，在每循環(huán)的復(fù)性階段讀取熒光強(qiáng)度。熔解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置，具體為：95 ℃ 10 s，65 ℃至95 ℃(每5 s增加0.5 ℃，并讀取熒光強(qiáng)度)。所選用引物如表1所示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Excel 2007 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，使用SPSS 21 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗凍性鑒定

如圖1所示，冷馴化前(0 d)，W 3與Cph 12在-5 ℃所受凍害無顯著性差異。隨著冷馴化的進(jìn)行，W 3的抗凍性逐步增強(qiáng)，到12 d時(shí)，植株可以經(jīng)受-5 ℃的低溫而無明顯凍害性狀；Cph 12的抗凍性隨冷馴化時(shí)間的延長無明顯變化。到12 d時(shí)，-5 ℃的低溫處理導(dǎo)致植株全部死亡。

2.2 冷馴化過程中馬鈴薯野生種葉綠素和光合速率含量變化

兩種馬鈴薯野生種冷馴化過程中葉片葉綠素及光合速率變化結(jié)果見圖2。從圖2可知，W 3植株葉片凈光合速率在冷馴化前期顯著降低；隨著冷馴化時(shí)間的延長，逐步恢復(fù)。而Cph 12中葉片凈光合速率在前期降低后，雖然在后期有所增加，但是未達(dá)到顯著水平。與之相對(duì)應(yīng)，W 3葉片中葉綠素含量有一個(gè)顯著的增加過程，而Cph 12中葉綠素含量始終無顯著性變化。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

以微管蛋白為內(nèi)參，5個(gè)蛋白基因：葉綠體放氧增強(qiáng)蛋白1、葉綠體甘油醛-3-磷酸脫氫酶、葉綠體錳穩(wěn)定蛋白-Ⅱ、葉綠體細(xì)胞色素f、葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ修復(fù)蛋白PSB 27-H 1、在冷馴化期間的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量結(jié)果見圖3。由圖3可知，葉綠體放氧增強(qiáng)蛋白1、葉綠體錳穩(wěn)定蛋白-Ⅱ與葉綠體細(xì)胞色素f在轉(zhuǎn)錄水平先降低，后升高，再降低。葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ修復(fù)蛋白PSB 27-H 1在轉(zhuǎn)錄水平先升高，后降低。葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶在W 3中先升高，后降低；在Cph 12中先降低，后升高，再降低。結(jié)果表明，所選擇基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律在兩個(gè)材料中具有較大的相似性。

3 討論與結(jié)論

光自養(yǎng)生物可以根據(jù)溫度和輻照度的變化來調(diào)整光合組織的結(jié)構(gòu)和功能，以維持細(xì)胞能量平衡；而溫度或輻照度的變化都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量的不平衡[7]；活性氧在低溫下過度積累，使光系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ的光合反應(yīng)過程中吸收的能量與卡爾文循環(huán)中消耗的能量不平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[11]。光合生物可以通過光合電子傳遞鏈的氧化還原狀態(tài)來感知溫度的變化，而氧化還原狀態(tài)又通過調(diào)節(jié)核基因表達(dá)和葉綠體生物合成來控制表型[7]。

植物冷馴化是一個(gè)需要能量的過程，從來源考慮，能供給冷馴化所需的能量只有前期儲(chǔ)藏的能量和光合作用固定的光能；當(dāng)前者不足時(shí)(如植株苗期，或者植物處于低溫條件時(shí)間過長等情況)，光合系統(tǒng)能夠在冷馴化條件下發(fā)揮作用，成為植物冷馴化能力實(shí)現(xiàn)的必要條件。Smith等[12]研究表明，通過增加光合作用限速酶Rubisco含量，可以有效增強(qiáng)玉米的耐冷性。本研究表明，冷馴化過程中，W 3中葉綠素(Chl)含量顯著升高，而Cph 12中Chl含量變化未達(dá)到顯著水平；與之相對(duì)應(yīng)，W 3植株凈光合速率在冷馴化前期顯著降低，后期逐漸恢復(fù)到冷馴化前的水平，而Cph 12中植株凈光合速率在前期降低后，后期未見顯著恢復(fù)。該結(jié)果在一定程度上支持前述結(jié)論。

植物的抗寒性是受多基因控制的數(shù)量性狀，其抗寒性狀的表達(dá)需要經(jīng)過一定時(shí)間和溫度的誘導(dǎo)[13]。李飛[14]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯野生種S.acaule具有冷馴化能力，冷馴化處理可以將其半致死溫度(LT 50)從-6～-4 ℃提高到-10～-8 ℃。不同植物的冷馴化能力差異是由基因決定的[15]。本研究通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)馬鈴薯野生種冷馴化過程中涉及光合表達(dá)的五種蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，馬鈴薯冷馴化過程中，這五種光合相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)確實(shí)發(fā)生了改變，其中葉綠體放氧增強(qiáng)蛋白1、葉綠體錳穩(wěn)定蛋白-Ⅱ、葉綠體細(xì)胞色素f、葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ修復(fù)蛋白PSB 27-H 1在轉(zhuǎn)錄水平的變化在兩種材料中表達(dá)具有較大的相似性；而葉綠體甘油醛-3-磷酸脫氫酶在W 3進(jìn)行冷馴化1 h后即開始顯著上調(diào)表達(dá)，到第4天，其表達(dá)量顯著降低，表明其參與了馬鈴薯對(duì)冷馴化低溫環(huán)境的應(yīng)急響應(yīng)過程。李娜娜等[16]研究表明，高溫脅迫下sHSP 26 通過調(diào)控光合作用相關(guān)蛋白(如放氧增強(qiáng)子蛋白、葉綠素a/b 結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素b 6/f 復(fù)合體鐵硫亞基等)來影響玉米葉綠體的耐熱性。蔣樂等[17]利用短日照處理油松容器苗蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，葉綠體放氧增強(qiáng)蛋白 1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶上調(diào)表達(dá)，表明光合代謝參與油松容器苗的抗逆性。

綜合上述結(jié)果推測(cè)，光合系統(tǒng)對(duì)冷馴化條件的適應(yīng)可能是馬鈴薯冷馴化能力實(shí)現(xiàn)的必要條件。