焦 寧，尹大川，宋瑞清

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,沈陽110161）

松樹萎蔫病（pine wilt disease，PWD）是由松材線蟲（Bursaphelenchusxylophilus）引發(fā)的松樹毀滅性病害[1]。該病害在我國嚴重流行，對森林生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大破壞，主要通過松墨天牛（Monochamusalternatus）等媒介昆蟲傳播，寄主主要包括黑松（Pinusthunbergii）、赤松（Pinusdensiflora）、馬尾松（Pinusmassoniana）等松屬植物，被線蟲侵染的松樹，針葉呈黃褐色或紅褐色，整株迅速干枯死亡[2]。目前，針對松樹萎蔫病的防治還是以化學(xué)藥劑為主，而綠色環(huán)保的生物防治研究還處于起步階段，本研究分析了對松材線蟲具有抑制作用的棘孢木霉（Trichodermaasperellum），揭示了線蟲誘導(dǎo)木霉防衛(wèi)反應(yīng)的分子機制，為生物防治松材線蟲提供了新的思路。

棘孢木霉（T.asperellum）是一種廣泛應(yīng)用于植物病害領(lǐng)域的生防菌，木霉通過代謝產(chǎn)生的水解酶、抗生素等活性物質(zhì)對病原物產(chǎn)生高效抑制的作用[3]。研究表明，棘孢木霉能夠有效抑制終極腐霉菌（Pythiumultimum）生長[4]。張鍇等[5]在哈茨木霉（Trichodermaharzianum）體內(nèi)找到了與松材線蟲相關(guān)的抗性基因P450。然而，目前對松材線蟲誘導(dǎo)棘孢木霉分子抗病機制還鮮有研究，已報道的木霉生防基因主要包括幾丁質(zhì)酶、外切β-1，3-葡聚糖酶以及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶等水解酶類[6]，其中還有很多誘導(dǎo)抗病機制的基因有待發(fā)掘。

近年來，高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于真菌的組學(xué)研究當(dāng)中。為更深入地研究松材線蟲誘導(dǎo)棘孢木霉的分子抗病機制，對線蟲處理過的棘孢木霉T203菌株進行了轉(zhuǎn)錄組分析，根據(jù)相關(guān)抗性基因的功能注釋、結(jié)構(gòu)域分析以及相關(guān)的文獻報道，找到了棘孢木霉T203的抗病相關(guān)基因，這不僅豐富了棘孢木霉的基因表達譜，也為松材線蟲誘導(dǎo)木霉的分子防衛(wèi)反應(yīng)機制提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

棘孢木霉（T.asperellum）T203由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林病理實驗室提供。松材線蟲（B.xylophilus）和灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）由中國林科院森環(huán)森保所提供。

1.2 主要儀器

電子分析天平、滅菌鍋、分光光度計、高速離心機、超凈工作臺、熒光定量PCR儀、-80℃超低溫冰箱、4℃冰箱。

1.3 培養(yǎng)基制備與供試菌株、線蟲的培養(yǎng)

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：紗布包裹的新鮮馬鈴薯碎塊200g煮至沸騰，加入葡萄糖和瓊脂各20g，過濾后使用蒸餾水定容至1L，分裝至錐形瓶中，121℃高壓滅菌30min備用。

使用平板PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)棘孢木霉T203與灰葡萄孢，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中14d，待平板內(nèi)長滿菌絲進行后續(xù)試驗。

使用灰葡萄孢培養(yǎng)基培養(yǎng)松材線蟲7d，待菌絲被線蟲取食干凈，培養(yǎng)基表面近光滑油狀，表明線蟲長滿培養(yǎng)基準(zhǔn)備收集使用。

1.4 松材線蟲的收集與懸浮液制備

將培養(yǎng)好的線蟲采用貝爾曼漏斗法[7]，靜置6～8h，收集至離心管中，使用3500r·min-1離心機離心5min，使用PBST緩沖液沖洗3次，配制成20條·μL-1的線蟲懸浮液，置于4℃冰箱保存。

1.5 供試菌株的處理與取樣

選取長勢優(yōu)良的棘孢木霉用于試驗，處理組（T）向木霉菌板中接入500μL線蟲懸浮液（約10000頭），對照組（CK）加入等量的無菌水，各進行3次生物學(xué)重復(fù)，樣品編號分別為T1、T2、T3與CK1、CK2、CK3，于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，濾掉線蟲，將菌絲收集至1.5mL離心管中，每管菌絲約100mg，液氮處理后使用干冰運送至哈爾濱諾禾致源生物公司進行測序。

1.6 測序樣品的數(shù)據(jù)質(zhì)控

利用CASAVA將高通量測序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)。為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從原始數(shù)據(jù)中去除帶接頭及平均質(zhì)量分數(shù)低于Q20的數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)過濾、錯誤率檢測、GC分布情況，獲得可靠的clean reads。

1.7 差異表達基因的篩選

進行測序深度校正，將原始的read count標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用統(tǒng)計學(xué)模型進行假設(shè)檢驗概率（pvalue）的計算，多重假設(shè)檢驗校正后，得到padj值，依據(jù)|log2(FoldChange)|＞0且padj＜0.05的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達基因[8]。

1.8 功能注釋

使用cluster Profiler對差異基因進行GO功能富集和KEGG途徑富集聚類，根據(jù)超幾何分布原理將差異基因集注釋到GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)基因的功能注釋與代謝途徑對差異基因集進行富集分析。

1.9 qRT-PCR驗證

為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，選取12個顯著差異的抗病相關(guān)基因進行qRT-PCR驗證。使用TaKaRa Mini BESTUniversal RNA Extrction Kit提取處理組（T）與對照組（CK）樣本菌絲總RNA。使用DNaseI（Promega）消化總RNA中的DNA，測定其質(zhì)量濃度。反應(yīng)條件如下：42℃60min；85℃5s；16℃10min。將合成的cDNA稀釋10倍，用于qRT-PCR。擴增內(nèi)參基因Actin[9]以及12個差異基因的引物序列如表1，使用CFX96 Real-time PCR Detection進行qRTPCR。反應(yīng)體系如下：10μL 2×SYBR premix Ex Taq酶、正向和反向引物(10μmol·L-1)各1μL，2μL稀釋的cDNA模板，加去離子水補足至20μL。反應(yīng)系統(tǒng)如下：94℃預(yù)變性30s，94℃變性12s，60℃退火45s，72℃延伸45s，81℃讀板1s，45個循環(huán)，每個樣品重復(fù)3次。通過標(biāo)準(zhǔn)2-ΔΔCT方法計算每個基因的相對表達水平，使用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)誤差分析與差異顯著性分析，所有試驗數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗（p＜0.05）[10]。

表1 試驗用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

棘孢木霉T203的測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)Trimmomatic質(zhì)控過濾后，采用FastQC質(zhì)量評價。由表2可知，每個測序樣品過濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)后的Clean data均超過95%，錯誤率為0.02%～0.03%，其中，Q20百分比為97%以上，Q30百分比也達到94%以上，GC含量接近50%，說明測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量合格。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Table 2 Quality evaluation of sequencing data

2.2 基因表達分布

通過計算各樣本所有基因的表達量（FPKM），得到不同樣本基因表達水平的分布情況，結(jié)果如圖1?；虮磉_量的中位數(shù)比較接近，表明各樣本的基因表達水平總體相似，但處理組（T）與對照組（CK）的基因表達情況也存在明顯差異。

圖1 各樣本基因轉(zhuǎn)錄分布情況Figure 1 Gene transcription distribution of each sample

2.3 樣本間相關(guān)性分析

樣本間基因表達水平相關(guān)性是檢驗差異表達基因可信度的重要指標(biāo)。使用FPKM方法檢測各樣本間的相關(guān)性，通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示，相關(guān)系數(shù)在0.8～1之間屬于極高相關(guān)。由圖2可知，各樣本相關(guān)系數(shù)均高于0.8，表明各樣本間具有較好的重復(fù)性與極高的相關(guān)性，可信度高。

圖2 樣品相關(guān)性系數(shù)統(tǒng)計圖Figure 2 Statistical chart of sample correlation coefficient

2.4 差異表達基因的篩選

差異表達基因篩選結(jié)果如圖3，經(jīng)松材線蟲處理的棘孢木霉T203總共獲得964個差異表達基因，其中包含371個上調(diào)表達基因，583個下調(diào)表達基因。

圖3 差異表達基因火山圖Figure 3 Differential expression gene Volcano plot

2.5 差異表達基因的聚類分析

對差異表達基因進行聚類分析，橫向比較為同一基因在不同樣本中的表達情況，結(jié)果如圖4。處理組（T）中表達量高的基因在對照組（CK）中低，處理組（T）中表達量低的基因在對照組（CK）中高，處理組（T）與對照組（CK）表達模式相反。

圖4 差異表達基因聚類熱圖Figure 4 Clustering heatmap of differentially transcribed genes

2.6 GO功能富集分析

根據(jù)差異表達基因的功能將GO功能富集分為3個大類，分別是細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物學(xué)過程（biological process）。細胞組分指細胞結(jié)構(gòu)的成分，這類基因主要參與細胞活動；分子功能主要涉及催化活性與信號識別相關(guān)的基因；生物學(xué)過程包括生物代謝途徑與信號傳導(dǎo)運輸相關(guān)的基因。GO富集分析結(jié)果如圖5，其中，參與生物學(xué)過程（BP）的差異基因最多，其次是細胞組分（CC）、分子功能（MF）。生物學(xué)過程（BP）主要包括有氨基酸轉(zhuǎn)運、有機氮化合物生物合成、肽生物合成、酰胺生物合成、蛋白質(zhì)代謝等過程。細胞組分（CC）主要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白、泛素蛋白、磷酸核糖激酶、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等誘導(dǎo)細胞質(zhì)與細胞膜的合成。分子功能（MF）主要包括催化酶活性、連接酶活性以及聚合酶活性。

2.7 KEGG富集分析

KEGG總共富集到75個代謝途徑，包括333個差異表達基因，其中105個基因顯著上調(diào)表達，篩選出前20個最顯著的KEGG代謝途徑進行分析，結(jié)果如圖6。這些差異表達基因主要富集在以下代謝途徑：過氧化物酶體、氰氨基酸代謝、脂肪酸代謝、甲烷代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸降解、精氨酸和脯氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、碳代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成磷酸戊糖途徑、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸生物合成、氮素代謝、抗生素的生物合成、果糖和甘露糖代謝、組氨酸代謝、酪氨酸代謝。

圖6 KEGG代謝途徑富集分析Figure 6 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway

2.8 抗病相關(guān)的MAPK信號途徑及基因

在KEGG富集代謝途徑中，具有誘導(dǎo)抗病功能的分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號途徑中共有5個基因顯著上調(diào)表達，結(jié)果如表3。這些基因分別包括G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白、Mcm1轉(zhuǎn)錄因子、Rho GTPase激活蛋白、RNA聚合酶蛋白以及過氧化氫酶。

表3 MAPK信號途徑差異表達相關(guān)基因Table 3 Differential expression related genes of MAPK signal pathway

2.9 棘孢木霉抗性基因篩選與qRT-PCR驗證

通過基因注釋，從顯著上調(diào)表達的差異基因中篩選12個參與棘孢木霉防衛(wèi)反應(yīng)的抗病相關(guān)基因，結(jié)果如表4。這些基因分別為短鏈脫氫酶、細胞色素P450、bZIP轉(zhuǎn)錄因子、泛素結(jié)合酶、糖苷水解酶16家族、G蛋白信號調(diào)控因子、β-1，3葡聚糖酶、枯草桿菌蛋白酶、LysM受體激酶、醛酮還原酶、乙醛脫氫酶和過氧化氫酶。這些基因在松材線蟲誘導(dǎo)的棘孢木霉T203轉(zhuǎn)錄組中顯著上調(diào)表達。

表4 棘孢木霉抗性功能基因Table 4 Resistance genes of Trichoderma asperellum

通過熒光定量（qRT-PCR）對松材線蟲處理的棘孢木霉T203菌株中12個抗病相關(guān)基因進行驗證。將處理組（T）與對照組（CK）的基因表達情況同轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行比較，結(jié)果如圖8。盡管某些基因的差異表達倍數(shù)存在偏差，但整體的上調(diào)趨勢一致，基因表達水平與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)接近，因此棘孢木霉T203的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)具備可靠性。

3 討論與結(jié)論

木霉菌生防效果顯著，應(yīng)用廣泛，主要通過重寄生作用、競爭作用、抗生作用、促進植物生長發(fā)育以及誘導(dǎo)植物抗病機制等發(fā)揮其生防功能[11]。木霉菌在代謝過程中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等降解酶類以及活性抗生物質(zhì)對病原生物具有良好的抑制作用[12]。研究表明，木霉菌可有效抑制尖刀鐮孢菌（Fusariumoxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctoniasolanisolani）等病原真菌的孢子萌發(fā)，對根結(jié)線蟲也有一定的抗性作用[13-14]。本試驗通過棘孢木霉作用松材線蟲，同樣發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長線蟲死亡率逐漸上升，因此，證明了棘孢木霉對松材線蟲具有很好的抑制作用。隨著當(dāng)代分子科技的迅速發(fā)展，對真菌轉(zhuǎn)錄組研究也越來越多[15]，KAWAHARA等[16]對稻瘟病菌與感病水稻分別進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)了水稻的植物保護素合成基因以及稻瘟病菌的致病基因。SUN等[17]對寄生在核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）上的粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachysrosea）的轉(zhuǎn)錄組測序分析中發(fā)現(xiàn)了與重寄生相關(guān)的基因。本研究通過RNA-Seq分析了松材線蟲處理棘孢木霉T203菌株72h的差異表達基因，結(jié)果共檢測到964個差異表達基因，這些差異基因富集到不同的GO功能及KEGG代謝通路中，反映了松材線蟲誘導(dǎo)棘孢木霉T203在抗病過程中具有重要作用。

在棘孢木霉T203轉(zhuǎn)錄組的差異表達基因分析中發(fā)現(xiàn)，差異顯著的基因主要集中在細胞壁與細胞膜的降解酶、細胞色素P450、糖苷水解酶、信號傳導(dǎo)因子、MAPK信號途徑、絲氨酸蘇氨酸代謝途徑、谷胱甘肽代謝途徑、抗生素生物合成、過氧化物酶體等調(diào)控途徑上。這些基因主要包括細胞壁降解酶、細胞膜降解酶、參與細胞壁修復(fù)途徑的相關(guān)基因、參與抗生素代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)基因、谷胱甘肽代謝途徑中關(guān)鍵的解毒酶基因以及參與細胞抗氧化反應(yīng)的相關(guān)基因。大量研究表明，水解酶代謝途徑對病原生物的細胞壁與細胞膜具有降解作用[18]，細胞色素P450是一類高效的抗性基因[19]，絲氨酸蘇氨酸代謝途徑對維持細胞完整性、細胞周期、調(diào)節(jié)細胞滲透壓、以及對外界生物及非生物因素影響都具有重要作用[20]。MAPK信號途徑對調(diào)控真菌生長發(fā)育具有重要意義[21]，谷胱甘肽代謝途徑與過氧化物酶體應(yīng)對外緣刺激能自身誘導(dǎo)解毒代謝機制以及抗氧化反應(yīng)[22]?？傊?，棘孢木霉在松材線蟲刺激下所發(fā)揮的生物防衛(wèi)反應(yīng)機制是由多個基因參與共同調(diào)控作用的結(jié)果。

本研究旨在探索松材線蟲誘導(dǎo)棘孢木霉T203的分子抗病機制，首先激發(fā)棘孢木霉對病原線蟲入侵的信號識別機制，通過松材線蟲與棘孢木霉菌絲的相互作用，誘導(dǎo)木霉體內(nèi)合成水解酶以及抗生素等活性代謝產(chǎn)物，這種接觸是病原物對生防菌菌絲的纖維素結(jié)合區(qū)域以及凝集素介導(dǎo)蛋白質(zhì)表達模式的G蛋白和MAPK信號的聯(lián)合反應(yīng)[23]，該信號識別傳遞與誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)機制在松材線蟲與棘孢木霉的互作中得以充分體現(xiàn)。研究表明，木霉生防機制啟動是對病原物的識別，而G蛋白在信號識別與傳遞中起到關(guān)鍵作用[24]，在識別成功后，木霉菌絲會附著在線蟲體表，啟動防衛(wèi)反應(yīng)機制，通過分泌水解酶、蛋白酶溶解線蟲的細胞壁與細胞膜，產(chǎn)生抗生作用的次生代謝產(chǎn)物[25]，通過自身代謝反應(yīng)誘導(dǎo)因線蟲刺激引起的抗氧化反應(yīng)與解毒抗逆機制，從而發(fā)揮抗病功能。

細胞壁是線蟲對外的第一層防御系統(tǒng)，在維系細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定方面具有重要意義，同時對外界不利環(huán)境提供很好的生物屏障[26]。SYAMA等[27]研究發(fā)現(xiàn)粘帚霉菌產(chǎn)生的β-1，3-葡聚糖酶不僅可以抑制鐮刀菌（Fusariumsp.）和腐霉菌（Pythiumsp.）的孢子萌發(fā)與生長，還可以降解細胞壁、形成附著孢結(jié)構(gòu)；LI等[28]發(fā)現(xiàn)粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachysrosea）的枯草桿菌蛋白酶基因PrC能夠固定線蟲并降解線蟲體壁；WANG等[29]從洛斯里被毛孢（Hirsutellarhossiliensis）中提取出的枯草桿菌蛋白酶基因?qū)€蟲體壁也有降解作用。本試驗在棘孢木霉T203的差異表達基因中發(fā)現(xiàn)了顯著上調(diào)表達的糖苷水解酶16家族、β-1，3-葡聚糖酶以及屬于絲氨酸蛋白酶家族的枯草桿菌蛋白酶，表明這些水解酶對降解松材線蟲的細胞壁及細胞膜發(fā)揮著重要的作用。

外界有害生物的刺激往往導(dǎo)致生物細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）過量累積，加速細胞膜脂過氧化反應(yīng)，生成醇類、醛類等有毒物質(zhì)，從而破壞核酸及蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能，造成細胞過氧化損傷[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，在棘孢木霉T203的差異表達基因中有一些有關(guān)抗氧化與降解毒素的關(guān)鍵基因，包括過氧化氫酶、乙醛脫氫酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）、醛酮還原酶等，其中谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）與醛酮還原酶在谷胱甘肽代謝途徑中顯著上調(diào)表達。以往研究表明，谷胱甘肽代謝途徑可以激活相關(guān)抗性基因、誘導(dǎo)抗毒素的積累[31]，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）對植物抵御外源生物具有重要作用[32]。KONG等[33]在黃瓜抗灰霉病的研究中篩選出27個谷胱甘肽代謝途徑中的基因。以上表明，這些基因與其調(diào)控的代謝途徑在松材線蟲誘導(dǎo)棘孢木霉抗病過程中同樣發(fā)揮著解毒代謝與誘導(dǎo)抗逆性的功能。

在研究菌絲生長發(fā)育與應(yīng)激信號識別傳導(dǎo)方面，本試驗從KEGG顯著富集的代謝途徑中發(fā)現(xiàn)了至關(guān)重要的MAPK信號途徑，相關(guān)研究表明，MAPK信號途徑對細胞的糖基化狀態(tài)敏感，在外界生物或非生物刺激下通過信號識別與傳導(dǎo)激發(fā)相關(guān)抗逆蛋白酶活性，調(diào)節(jié)外源因素造成的細胞壁損傷，是維系真菌孢子萌發(fā)與菌絲正常生長發(fā)育的必要信號傳導(dǎo)途徑[34]，同時MAPK信號途徑在真菌對病原物產(chǎn)生抗性作用、誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)機制、形成氣生菌絲與分生孢子等方面也具有重要作用[35]。經(jīng)松材線蟲處理棘孢木霉T203菌株的MAPK信號途徑中，本試驗發(fā)現(xiàn)，G蛋白調(diào)節(jié)因子顯著上調(diào)表達，該基因可以促進菌絲生長并對線蟲的刺激進行信號識別與傳導(dǎo)；研究表明轉(zhuǎn)錄因子Mcm1可以促進細胞完整性，對細胞周期和毒力進行調(diào)控[36]；王亞等[37]在木霉菌H6菌株防治香蕉枯萎病的研究中發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶活力升高與香蕉抗病性呈正相關(guān)，這些基因在MAPK信號途徑中這些基因都顯著上調(diào)表達，表明棘孢木霉的MAPK信號途徑及其相關(guān)基因在菌絲生長發(fā)育、細胞信號傳導(dǎo)運輸以及在有害生物引起的過氧化反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用從而誘導(dǎo)棘孢木霉抗病機制。

圖7 12個抗病相關(guān)基因相對轉(zhuǎn)錄水平Figure 7 Relative transcription of 12 disease resistance-related genes

通過基因功能及相關(guān)代謝途徑分析，本試驗在差異表達基因中篩選出12個棘孢木霉抗病相關(guān)功能的基因，并分別進行注釋與qRT-PCR分析。結(jié)果表明，這些基因均顯著上調(diào)表達，這與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的表達模式相似，表明這些基因在松材線蟲誘導(dǎo)木霉抗病反應(yīng)的分子機制中發(fā)揮著重要作用，同時也證實了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

從松材線蟲處理棘孢木霉T203菌株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共篩選出964個差異表達基因，其中371個上調(diào)表達，583個下調(diào)表達。GO功能富集到氨基酸轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)合成與代謝、細胞合成以及催化酶活性等相關(guān)功能的基因，KEGG代謝途徑富集到抗生素生物合成、氨基酸代謝、谷胱甘肽代謝、過氧化物酶體等相關(guān)功能的基因。在KEGG代謝途徑中，本研究發(fā)現(xiàn)了參與菌絲生長發(fā)育及信號識別傳導(dǎo)的MAPK信號途徑，并從中分析G蛋白、過氧化氫酶等有關(guān)信號識別與誘導(dǎo)抗病機制的關(guān)鍵基因。最后，依據(jù)差異表達基因的功能注釋篩選出12個顯著上調(diào)表達的抗病基因，它們主要編碼信號傳導(dǎo)因子、抗氧化酶、水解酶、解毒酶、抗生素等，并對這些基因進行了qRT-PCR驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12個基因顯著上調(diào)表達且表達模式與測序數(shù)據(jù)趨勢一致，表明這些基因在誘導(dǎo)棘孢木霉抗病機制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。