張于錳，陳語嫣，劉艷

廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建省化學(xué)生物學(xué)重點實驗室(廈門大學(xué))，福建 廈門 361005

在功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價相互作用研究方面，酶的抑制劑篩選是重要的應(yīng)用領(lǐng)域之一，在藥物研發(fā)方面具有極其重要的科學(xué)意義及社會價值。質(zhì)譜技術(shù)因其高靈敏、快速、高效、樣品消耗量小(pmol-fmol)等特點，在非共價復(fù)合物研究方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力，與H/D交換技術(shù)相聯(lián)合還可以描述蛋白折疊動力學(xué)過程[1]。通過“Intensity-Fading”間接的質(zhì)譜檢測技術(shù)也可以有效獲得蛋白質(zhì)與配體相互作用位點及作用本質(zhì)信息[2]。

1 質(zhì)譜技術(shù)研究功能小分子與蛋白質(zhì)相互作用的基本策略

電噴霧電離(Electrospray Ionization，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix Assisted Laser Dissociation Ionization，MALDI)是研究功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價相互作用常用的軟電離質(zhì)譜離子源。

質(zhì)譜研究功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價相互作用成功的關(guān)鍵是保證蛋白質(zhì)是在“天然”狀態(tài)下進行質(zhì)譜測試。通常可以使用溫和的電壓(例如，錐孔電壓Cone Voltage)、毛細管溫度等儀器測試參數(shù)和采取溫和的樣品制備策略，來實現(xiàn)蛋白質(zhì)在“天然”狀態(tài)下的質(zhì)譜測試。蛋白質(zhì)、多肽的分子量較大，在質(zhì)譜中的離子化效率較低。因此，為了提高蛋白質(zhì)、多肽在質(zhì)譜中的離子化效率及檢測靈敏度，往往在樣品制備過程中，將蛋白、多肽溶于含0.1% HCOOH或0.1% HOAc并含一定比例乙腈或甲醇的水溶液中。然而，這樣的樣品溶液配制方法對蛋白質(zhì)非共價復(fù)合物的檢測非常不利，強酸環(huán)境、有機溶劑的使用，會降低非共價復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致復(fù)合物結(jié)構(gòu)解離。具體來說，pH越低，有機溶劑含量越高，蛋白質(zhì)與功能小分子的非共價復(fù)合物越容易解離[3]。除了蛋白樣品緩沖溶液pH、有機溶劑外，所有能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)變性的因素都不利于蛋白質(zhì)非共價復(fù)合物的穩(wěn)定存在。因此，質(zhì)譜毛細管溫度和工作電壓在研究蛋白質(zhì)非共價復(fù)合物時也是需要考慮優(yōu)化的重要因素。

肌紅蛋白(Myoglobin)，是組成骨骼肌和心肌的主要蛋白質(zhì)。當肌肉損傷時，肌紅蛋白就從肌肉組織中漏到循環(huán)血液中，使血清肌紅蛋白濃度增加。臨床上常用該指標來判斷是否發(fā)生肌肉損傷。由于肌紅蛋白自身就是通過血紅素輔基鐵卟啉與蛋白質(zhì)的非共價相互作用而形成的蛋白復(fù)合物，常常用其來衡量非共價蛋白復(fù)合物的質(zhì)譜測試參數(shù)的有效性。

2 實驗設(shè)計

功能小分子與蛋白質(zhì)的相互作用研究最為典型的應(yīng)用就是酶的抑制劑篩選?；谫|(zhì)譜技術(shù)的酶抑制劑篩選方法可分為直接篩選法(圖1A，1B)和間接篩選法(圖1C)[4]。圖1A中，通過直接檢測酶-抑制劑復(fù)合物，實現(xiàn)小分子酶抑制劑的直接篩選；圖1B中，先利用質(zhì)譜“釣”到酶-抑制劑復(fù)合物后，通過測試條件的改變，實現(xiàn)復(fù)合物的解離，再利用質(zhì)譜直接檢測、鑒定小分子抑制劑；圖1C中，則以酶底物的酶解產(chǎn)物為“報告分子”，利用質(zhì)譜檢測“報告分子”間接實現(xiàn)抑制劑的篩選。

圖1 基于質(zhì)譜技術(shù)的酶抑制劑篩選策略[4]

本實驗選擇以肌紅蛋白為模型蛋白，來模擬酶抑制劑的直接篩選方法(圖1B)，通過測試樣品溶液條件的改變，考查pH環(huán)境及有機溶劑對肌紅蛋白復(fù)合物的電噴霧質(zhì)譜全掃描譜的差異，讓學(xué)生觀察肌紅蛋白的測試條件對其復(fù)合物測定的影響。此外，通過待測樣品中酸或有機溶劑的增加，實現(xiàn)復(fù)合物的完全解離釋放出小分子配體——血紅素輔基，即鐵卟啉環(huán)，計算蛋白復(fù)合物與蛋白質(zhì)的質(zhì)量差值，確定小分子配體鐵卟啉環(huán)輔基的分子離子峰，并對其進行二級質(zhì)譜解析，以獲得相應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息。

該實驗是在廈門大學(xué)化學(xué)生物學(xué)系早期的“化學(xué)生物學(xué)綜合實驗”[5]基礎(chǔ)上的進一步拓展。早期教學(xué)實驗僅進行了測試樣品溶液條件的改變對復(fù)合物質(zhì)譜測定的影響考查，沒有引入酶抑制直接篩選應(yīng)用策略的介紹以及二級質(zhì)譜對小分子配體的定性分析。改進后的實驗更有利于學(xué)生利用簡單的模型蛋白復(fù)合物，全面理解基于電噴霧多級質(zhì)譜技術(shù)的功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價相互作用研究的實際應(yīng)用。

選擇肌紅蛋白作為本實驗的研究對象有三個根本設(shè)計原因。其一，肌紅蛋白是一種常規(guī)的商品化的蛋白質(zhì)，并且其本身就是蛋白質(zhì)與血紅素輔基的非共價相互作用復(fù)合物，可以有效模擬酶-抑制劑復(fù)合物，樣品來源方便，便宜易得，有利于在大學(xué)本科基礎(chǔ)實驗教學(xué)中推廣使用；其二，以甲醇、醋酸作為蛋白質(zhì)復(fù)合物的變性劑以及互作破壞劑，考查這兩種常用的生物質(zhì)譜測試輔助試劑對血紅素輔基(抑制劑)與肌紅蛋白(酶)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響，并在線解離血紅素輔基，利用二級質(zhì)譜分析技術(shù)完成血紅素輔基定性分析過程，幫助學(xué)生利用簡單的模型更好地體會并了解實驗核心意義；其三，肌紅蛋白是被普遍認可的標準物質(zhì)，用來評價維系非共價蛋白質(zhì)復(fù)合物“天然”狀態(tài)的質(zhì)譜測試條件的有效性，直接選擇肌紅蛋白進行質(zhì)譜測試，有利于學(xué)生更好地了解其在質(zhì)譜上的譜學(xué)特性。

3 實驗操作

3.1 儀器與試劑

3.1.1 儀器

德國布魯克道爾頓公司AmaZon SL電噴霧離子阱質(zhì)譜；精密分析天平：賽多利斯精密天平(型號：BT224S，精確讀數(shù)0.1 mg)；漩渦混勻器：北京大龍MX-S可調(diào)式混勻儀。

3.1.2 試劑

馬心肌紅蛋白(Myoglobin,Mw≈ 17500)購自上海生工，市售的馬心肌紅蛋白本身含有血紅素輔基，或者稱為鐵卟啉輔基，為了便于討論，文中用“肌紅蛋白復(fù)合物”表示肌紅蛋白與鐵卟啉輔基之間存在弱相互作用的復(fù)合物形式；超純水Milli-Q純化(Millipore，Bedford，MA，USA，18.2 MΩ·cm)；甲醇(HPLC級)，Merck Co.(Darmstadt，德國)；醋酸(MS純)，Sigma Co.。

3.2 實驗步驟

3.2.1 樣品配制

Solution A：稱取1 mg馬心肌紅蛋白于1.5 mL離心管，加入1 mL超純水(此時肌紅蛋白水溶液的pH ≈ 9)，渦旋混勻器中混勻，國產(chǎn)0.22 μm聚醚砜樹脂(PES)針式過濾頭過濾，得到濃度為5.715 ×10-5mol·L-1的馬心肌紅蛋白儲備液。

Solution B1-B5：分別取100 μL Solution A于5個1.5 mL離心管中，再分別加入0、100、200、300、400 μL甲醇，以及400、300、200、100、0 μL超純水，混勻，備用。

Solution B6-B10：分別取100 μL Solution A、10 μL 0.1%醋酸水溶液于5個1.5 mL離心管中，再分別加入0、100、200、300、400 μL甲醇，400、300、200、100、0 μL超純水，混勻，備用。

Solution B1-B10的馬心肌紅蛋白的測試終濃度為1.143 × 10-5mol·L-1。

3.2.2 儀器操作

質(zhì)譜條件設(shè)置：

1) 全掃描質(zhì)譜：正離子模式；用流動注射泵進樣，流速為40 μL·min-1；掃描范圍600-2200m/z；Target mass 1200；Dry temperature 220 °C；nebulizer 7 Psi；Dry gas: 4.5 L·min-1; average: 5；Rolling Average: 15。

2) MS/MS質(zhì)譜：正離子模式；用流動注射泵進樣，流速為40 μL·min-1；掃描范圍200-1200m/z；Target mass 616；Dry temperature 220 °C；nebulizer 7 Psi；Dry gas: 4.5 L·min-1；average: 5；Rolling Average: 5。

3.2.3 數(shù)據(jù)分析

分別對Solution B1-B10待測溶液進行質(zhì)譜檢測，待總離子流穩(wěn)定后，保存此時掃描譜圖。利用儀器自帶的數(shù)據(jù)分析軟件(Compass DataAnalysis)進行數(shù)據(jù)分析，具體質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖2及圖3所示。圖2中，甲醇含量為0時(圖2a)，在上述質(zhì)譜檢測條件下，既觀察到肌紅蛋白復(fù)合物的質(zhì)譜多電荷信號峰，也檢測到了解離的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜信號峰，說明該質(zhì)譜檢測儀器參數(shù)還可以進一步優(yōu)化，以完全消除蛋白復(fù)合物的解離。隨著甲醇含量的逐步增加(圖2b和2c)，肌紅蛋白復(fù)合物的質(zhì)譜多電荷信號峰逐漸減弱，蛋白質(zhì)的質(zhì)譜信號逐漸增強，說明多數(shù)的蛋白以單體形式存在，當甲醇含量達到60%時，復(fù)合物基本都發(fā)生了解離，以蛋白質(zhì)單體形式存在，表現(xiàn)出多電荷的近似正態(tài)分布峰型(圖2d)，復(fù)合物自身的多電荷峰極弱(對應(yīng)圖2d中，帶15個電荷的分子離子峰1172.21m/z)。當甲醇濃度達到80%時(圖2e)，蛋白質(zhì)復(fù)合物離子化效率大大降低，蛋白質(zhì)單體多電荷峰不顯著。

圖2 不同甲醇比例下肌紅蛋白與其鐵卟啉環(huán)輔基弱相互作用電噴霧質(zhì)譜圖

另外，加入醋酸的組別(圖3)與不加醋酸的組別(圖2)相比，特別是圖3e與圖2e相比較，同樣是在80%的甲醇溶液中，酸的引入可以大大提升蛋白質(zhì)的離子化效率，表現(xiàn)出良好的質(zhì)譜檢測信號峰(圖3e)。這也說明了在蛋白質(zhì)、多肽的質(zhì)譜檢測過程中，加有機酸提高其離子化效率的重要性。另外，10 μL 0.1%醋酸的使用，甲醇含量為0時(圖3a)，完整的肌紅蛋白復(fù)合物以及解離蛋白質(zhì)可以同時檢測到，當甲醇含量提高到40%時，鐵卟啉環(huán)輔基與肌紅蛋白仍保持較為強烈的相互作用，除了部分解離的蛋白質(zhì)外，復(fù)合物的多電荷峰也可以顯著地檢測到，在質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)較為良好的近似正態(tài)分布的多電荷峰型(圖3c)。但是，當甲醇含量提高到60%時，肌紅蛋白復(fù)合物完全解離，釋放出鐵卟啉環(huán)輔基，在質(zhì)譜設(shè)定的掃描范圍中呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)的近似正態(tài)分布的多電荷峰型(圖3d)。

圖3 10 μL 0.1%醋酸環(huán)境不同甲醇比例肌紅蛋白與其鐵卟啉環(huán)輔基弱相互作用電噴霧質(zhì)譜圖

利用Compass DataAnalysis軟件中Deconvolution功能，對譜圖進行去卷積分析，可以獲得質(zhì)譜圖2、圖3上蛋白質(zhì)峰所帶電荷數(shù)的指認。通過多電荷峰的質(zhì)荷比，以及相應(yīng)的電荷數(shù)，可以推算出原蛋白質(zhì)的分子量。以圖3b為例，經(jīng)去卷積計算分析，圖中肌紅蛋白復(fù)合物平均分子量為17570.00 Da，鐵卟啉輔基解離后的肌紅蛋白平均分子量為16954.73 Da，兩者之間分子量相差615.27 Da，該丟失的分子量可能對應(yīng)肌紅蛋白復(fù)合物解離下來的相互作用的功能小分子鐵卟啉環(huán)輔基。

為探究該中性丟失小分子的結(jié)構(gòu)特征，對質(zhì)譜信號強且肌紅蛋白復(fù)合物完全解離的圖3e樣品進行二次測試，調(diào)節(jié)質(zhì)譜測試的掃描范圍為200-1200m/z，在該質(zhì)譜掃描范圍內(nèi)，尋找[615 + H]+峰，即616m/z質(zhì)譜信號峰。研究結(jié)果表明，圖3e樣品在掃描范圍200-1200m/z中，確實檢測到極強的616m/z質(zhì)譜信號峰，對該分子離子峰進行二級質(zhì)譜碎裂分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 分子量616.27捕獲的二級碎裂電噴霧質(zhì)譜峰

從圖4中可以觀察到，所捕獲的分子離子峰616.27m/z，經(jīng)二級質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離(Collision-Induced Dissociation，CID)后，最典型的碎裂特征是：中性丟失59 Da，產(chǎn)生碎片峰557.28m/z。中性丟失59 Da，可以通過C―C鍵的均裂，以乙酸自由基形式(·CH2COOH)離去而實現(xiàn)，因此，分析輔基結(jié)構(gòu)中可能含有乙酸基團，與鐵卟啉環(huán)輔基結(jié)構(gòu)特征一致(圖5)。

圖5 鐵卟啉環(huán)輔基結(jié)構(gòu)式

4 結(jié)語

質(zhì)譜測試之前的樣品前處理是質(zhì)譜測試結(jié)果好壞的關(guān)鍵。學(xué)生在大學(xué)四年級之前的儀器分析等理論課上對質(zhì)譜分析的基本原理等都有所了解，但是質(zhì)譜測試前的樣品前期準備的相關(guān)知識缺少培訓(xùn)。另外，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院“化學(xué)生物學(xué)綜合實驗”安排在大四秋季學(xué)期，學(xué)生正好都處于進入實驗室進行本科畢業(yè)論文設(shè)計實踐階段，有利用質(zhì)譜分析樣品的潛在需求。因此，在做實驗之前，結(jié)合PPT將背景知識以及常規(guī)質(zhì)譜配樣、上機操作的基本注意事項對學(xué)生進行詳細講解。引導(dǎo)學(xué)生掌握基本的質(zhì)譜分析、樣品制備的基本常識(如質(zhì)譜正負離子檢測模式選擇的依據(jù)、二級質(zhì)譜的測試意義、樣品脫鹽處理的基本方法、質(zhì)譜圖軟件分析方法等)。引導(dǎo)學(xué)生觀察、思考不同樣品測試條件下，肌紅蛋白復(fù)合物在電噴霧質(zhì)譜全掃描中的表現(xiàn)形式的差異形式是什么，差異產(chǎn)生原因是什么。蛋白樣品的稱量由助教完成。所有蛋白樣品溶液的配制由學(xué)生現(xiàn)場完成，現(xiàn)用現(xiàn)配。建議分組進行教學(xué)實驗，1組安排5-6名同學(xué)。每次實驗安排1組同學(xué)，可以統(tǒng)一配制一組Solution B1-10的待測樣品，小班教學(xué)實驗過程中可以保證每位同學(xué)都可以獨立進行實際的上機操作。整個實驗時長約3-4小時(包括PPT講解時間)。

最后，需要說明的是，本教學(xué)實驗提供了一種利用簡單的蛋白質(zhì)復(fù)合物模型來模擬酶抑制劑直接篩選過程的策略，適合于沒有現(xiàn)成“目標酶及潛在抑制劑”篩選體系的學(xué)校開展相關(guān)教學(xué)工作。如果原有教學(xué)平臺已具有“目標酶及潛在抑制劑”的篩選體系，可以將該質(zhì)譜實驗的設(shè)計原理直接用于自身的篩選體系。另外，為了讓學(xué)生在一次樣品測試中能同時觀察到肌紅蛋白復(fù)合物和解離的蛋白質(zhì)的多電荷質(zhì)譜信號峰，以及兩組多電荷質(zhì)譜峰的變化趨勢，不必讓學(xué)生過于刻意地、耗時地現(xiàn)場優(yōu)化出只有蛋白復(fù)合物而沒有解離峰的質(zhì)譜測試條件。此外，由于卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在CID二級質(zhì)譜碎裂模式下不容易碎裂，因此在探究其結(jié)構(gòu)的過程中，我們僅僅進行了二級質(zhì)譜裂解。對于其他實際樣品而言，若其小分子配體結(jié)構(gòu)在CID模式下容易解離為分子量不同的各種碎片離子，則可以進一步對其進行三級及以上的多級分析，對每一級碎裂下來的碎片峰進行多級分析可以更好地獲知并了解該配體更為詳盡的結(jié)構(gòu)信息，這也是多級質(zhì)譜在研究化合物結(jié)構(gòu)特征的優(yōu)勢和獨特作用。