李立章，柴子舒，汝 梅，蘇本偉，朱開昕，李永華**，陸海琳**

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530200；2.欽州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西欽州 535000)

0 引言

桑寄生，又稱桑上寄生，是桑寄生科Loranthaceae鈍果寄生屬Taxillus植物廣寄生Taxilluschinensis的干燥帶葉莖枝，是現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》(一部)(以下簡稱《藥典》)收載的藥材品種之一?！端幍洹分猩＜纳幉臑槎嗉闹鱽碓?，而桑樹寄生為單一寄主來源，即寄主僅為?？芃oraceae桑屬Morus植物桑樹Morusalba[1]。

近年來，圍繞寄主對寄生藥材質(zhì)量的影響，學(xué)者們做了大量的研究工作，從藥材顯微特征[2]、化學(xué)成分[3-8]、毒理[9]、藥理藥效[10,11]等多個方面展開研究，取得多項研究成果。研究發(fā)現(xiàn)，不同寄主植物的桑寄生總黃酮、槲皮素、槲皮苷等含量不同[3,4]，特別是寄主會通過它們之間的寄生關(guān)系，將寄主的特有成分向寄生藥材傳輸，從而對寄生藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響[12,13]。目前，對于桑寄生藥材的質(zhì)量檢查，《藥典》僅規(guī)定了強心苷的排除性檢查，即藥材不得檢出強心苷，才可作為桑寄生藥材使用[1]。但自然條件下的桑寄生藥材寄主來源復(fù)雜廣泛，除了含強心苷類型的有毒寄主外，還有大量的非強心苷類型的其他有毒寄主，如果只是完全按《藥典》執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，就會造成一些非強心苷類型的毒性寄主成為桑寄生藥材的來源寄主，使有毒的桑寄生藥材合法進(jìn)入流通和使用領(lǐng)域[9，14，15]。

本研究擬從寄主和寄生藥材成分的傳輸關(guān)系切入，以桑樹寄生藥材為研究對象，在參考《藥典》桑寄生藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，以柳樹、肉桂等寄主來源的寄生藥材作對照，通過高效液相色譜法同時對桑樹寄生藥材槲皮苷和桑辛素“雙指標(biāo)”成分含量進(jìn)行檢測，探討桑樹寄生藥材質(zhì)量控制的有效途徑，為科學(xué)指導(dǎo)臨床用藥，進(jìn)一步完善《藥典》桑寄生藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

桑樹寄生、柳樹寄生和肉桂寄生與其寄主植物桑枝、柳枝和桂枝藥材樣品均采自廣西野生環(huán)境區(qū)域，各種寄生藥材基源植物經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院郭敏副教授鑒定為桑寄生科植物廣寄生Taxilluschinensis(DC.) Danser，寄主分別為?？浦参锷orusalbaL.、楊柳科植物垂柳SalixbabylonicaL.、樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl，樣品采集信息見表1。

表1 樣品采集信息表

1.1.2 實驗試劑

甲醇(Fisher Scientific，色譜純)、乙腈(Fisher Scientific，色譜純)、磷酸(成都金山化學(xué)試劑有限公司，分析純)；槲皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：11538-201606，純度≥90.6%)；桑辛素對照品(成都麥德生科技有限公司，批號：RP190214，純度≥99.0%)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Waters e2695-2998/2489型高效液相色譜儀，KQ-5200B超聲波清洗儀(江蘇昆山超聲儀器有限公司),十萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號：CPA225D),電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：BHS-6),16K臺式離心機(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司),實驗室超純水儀器(廣西南寧市博美生物科技有限公司，型號：Direct-Q5UV)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱(5 μm，4.6×250 mm);流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(C);梯度洗脫：0-40 min，18%A-72%A，82%C-28%C，40-55 min，72%A，28%C)；檢測波長：0-30 min，256 nm(槲皮苷)，30-55 min，269 nm(桑辛素)。

1.2.2 對照品溶液制備

精密稱取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品16.78 mg、桑辛素16.25 mg分別置于10 mL和500 mL的容量瓶中，加入75%甲醇定容到刻度，即得1.678 mg/mL槲皮苷、0.032 mg/mL桑辛素的單一對照品溶液，精密吸取上述溶液各1 mL，定容到同一10 mL容量瓶中，得到每毫升含槲皮苷167.800 μg、桑辛素3.250 μg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備

依照蘇本偉等[16]最佳槲皮苷提取工藝，取桑樹寄生藥材粉末(SSJS-1) 0.50 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，稱量，浸泡1 h，超聲45 min，冷卻，補足失重，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

取1.2.2節(jié)的混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。槲皮苷的保留時間為12.126 min，桑辛素的保留時間為45.207 min，槲皮苷和桑辛素之間的分離度為9.1，大于2.0，達(dá)到良好的分離效果，該方法可用于同時檢測槲皮苷和桑辛素的含量。

1.槲皮苷Quercitrin,2.桑辛素Morusin

2.2 檢測限和定量限

分別取1.2.2節(jié)的槲皮苷和桑辛素對照品溶液適量，加溶劑溶解并稀釋成每毫升約含10 μg對照品的溶液，用溶劑逐級稀釋后，按1.2.1節(jié)的色譜條件進(jìn)樣測定。檢測限為信噪比≥3時所對應(yīng)的濃度，定量限為信噪比≥10時所對應(yīng)的濃度。得出槲皮苷和桑辛素檢測限分別為0.044，0.021 μg/mL，定量限分別為0.319，0.162 μg/mL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取1.2.2節(jié)混合對照品溶液，用75%甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。其中，槲皮苷質(zhì)量濃度為5.034，12.585，20.975，41.950，83.900，125.850和167.800 μg/mL，桑辛素質(zhì)量濃度為0.098，0.244，0.406，0.813，1.625，2.438和3.250 μg/mL。取10 μL混合對照品溶液進(jìn)樣，測定峰面積，以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，計算得出線性回歸方程(表2)。表明槲皮苷、桑辛素在上述濃度范圍呈良好線性關(guān)系。

表2 槲皮苷、桑辛素線性回歸方程

2.4 精密度試驗

精密吸取1.2.2節(jié)混合對照品溶液，在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計算對照品中槲皮苷的平均峰面積與桑辛素的平均峰面積，得到槲皮苷的RSD值為0.18%，桑辛素RSD值為0.85%，測量方法的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密稱取桑樹寄生(SSJS-1)粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，依照1.2.3節(jié)的方法平行制備，按照1.2.1節(jié)的色譜條件，每隔5 h進(jìn)行一次含量測定，計算24 h內(nèi)供試品溶液中槲皮苷與桑辛素的含量。槲皮苷RSD值為0.89%，桑辛素RSD值為1.75%，結(jié)果表明供試品溶液中槲皮苷與桑辛素在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取桑樹寄生(SSJS-1)粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，依照1.2.3節(jié)的方法平行制備，按照1.2.1節(jié)的色譜條件進(jìn)樣測定，計算供試品溶液中槲皮苷與桑辛素的含量，結(jié)果顯示槲皮苷RSD值為0.64%，桑辛素RSD值為2.86%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收試驗

精密稱取已知槲皮苷含量(2.29 mg/g)，桑辛素含量(3.56 μg/g)的桑樹寄生(SSJS-1)粉末6份，分別精密加入槲皮苷0.567 mg、桑辛素0.765 μg，依照1.2.3節(jié)的方法平行制備，按照1.2.1節(jié)的色譜條件進(jìn)樣測定，計算得出槲皮苷平均回收率為99.50%，RSD值為2.95%;桑辛素平均回收率為94.61%，RSD值為2.49%。

2.8 樣品測定

將表1中桑樹寄生、柳樹寄生、肉桂寄主與其寄主樣品依照1.2.3節(jié)的方法平行制備，按照1.2.1節(jié)的色譜條件進(jìn)樣測定，計算槲皮苷和桑辛素的平均含量。10批桑樹寄生均能檢測到槲皮苷和桑辛素，寄主桑枝也能檢測到桑辛素，柳樹寄生和肉桂寄生僅檢測到槲皮苷而檢測不到桑辛素。寄生樣品中槲皮苷的含量為1.98-3.11 mg/g，桑辛素的含量為0.27-4.27 μg/g (表3、圖2)。

表3 桑樹寄生、柳樹寄生、肉桂寄生與其寄主中槲皮苷和桑辛素的含量測定(n=3)

1.槲皮苷Quercitrin,2.桑辛素Morusin

3 討論

3.1 槲皮苷屬于桑樹寄生藥材基源植物廣寄生專屬性成分

現(xiàn)行《藥典》用槲皮素定性檢測來進(jìn)行桑寄生藥材質(zhì)量控制。研究發(fā)現(xiàn)，在桑寄生中游離槲皮素含量很低，在不酸解的情況下主要以槲皮苷的形式存在[17,18]。槲皮苷為黃酮類化合物,與人血清白蛋白的相互作用關(guān)系密切[19]，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血壓、抗心律失常等藥理作用[20]，槲皮苷符合作為桑樹寄生藥材質(zhì)量控制指標(biāo)成分的要求。本研究對桑樹寄生、柳樹寄生、肉桂寄生與其寄主中槲皮苷的含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示10批不同產(chǎn)地桑樹寄生與對照藥材柳樹寄生和肉桂寄生均能檢測到槲皮苷，而寄主桑枝、柳枝和桂枝則檢測不到槲皮苷，表明桑樹寄生中的槲皮苷與寄主無關(guān)，屬于藥材基源植物專屬性成分，即無論來自什么寄主，寄生藥材都含有這個成分。槲皮苷可作為桑樹寄生藥材質(zhì)量控制中“雙指標(biāo)”成分之一。

3.2 寄主桑樹特有成分桑辛素能傳輸?shù)缴浼纳幉?/h3>

研究發(fā)現(xiàn)，寄主會通過其與寄生之間的特殊關(guān)系，將寄主的一些次生代謝物質(zhì)傳輸?shù)郊纳幉闹胁⑦_(dá)到一定量的累積[14,15]，這也是寄主影響寄生藥材質(zhì)量的關(guān)鍵所在。在本研究中，桑枝、桑樹寄生均可檢測到桑辛素，而柳枝和柳樹寄生、桂枝和肉桂寄生均檢測不到桑辛素，說明桑辛素為寄主桑樹的特有成分，桑樹寄生的桑辛素是由寄主桑樹傳輸而來。研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了寄主會通過向其寄生傳輸寄主的特有成分，從而對寄生藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響。通過對桑寄生藥材進(jìn)行桑辛素成分檢測，可以鑒定其是否屬于桑樹寄主來源，桑辛素可作為桑樹寄生藥材質(zhì)量控制中“雙指標(biāo)”成分之二。

4 結(jié)論

本方法同時對槲皮苷和桑辛素“雙指標(biāo)”成分進(jìn)行含量檢測，方法簡便、可行。作為一種新的鑒別方法，本方法能鑒別寄主來源，實現(xiàn)對桑樹寄生藥材的質(zhì)量控制。同時，“雙指標(biāo)”成分檢測方法為其他寄主來源的寄生藥材質(zhì)量控制提供可借鑒的技術(shù)方法。