郭秋均 ，孫其偉

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科， 北京 100053；2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院預(yù)防保健科，北京 100091)

西黃丸是經(jīng)典的抗腫瘤名方，由牛黃、麝香、乳香、沒藥等組成，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，可以治療乳巖、橫、瘰、痰核等惡疾。目前西黃丸多以單用或配合現(xiàn)代抗腫瘤手段治療乳腺癌等腫瘤疾病。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)約占乳腺癌總發(fā)病率的15%～20%，由于缺乏雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2，對化療敏感性差，缺乏內(nèi)分泌、靶向治療等治療手段，通常被認為是最難治療的乳腺癌亞型[1]，免疫治療是其潛在有效治療方案[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，西黃丸治療三陰性乳腺癌有一定療效，但其作用機制有待進一步明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號節(jié)點進行多靶點藥物分析的方法，開啟了中醫(yī)藥多靶標與多種疾病間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系研究的新模式。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對西黃丸治療三陰性乳腺癌的關(guān)鍵靶點及其免疫學(xué)機制進行分析。

1 材料與方法

1.1 中藥復(fù)方作用靶點的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP，traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform https://tcmspw.com/tcmsp.php)對牛黃、麝香、乳香、沒藥以生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18且藥物半衰期(HL)≥4作為閾值進行篩選，對復(fù)方中藥的藥物作用靶點進行研究，OMIM數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，https://omim.org/)、Genecard數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)以及TCGA數(shù)據(jù)庫用于篩選三陰性乳腺癌的病理靶點。通過Venn圖對中藥藥物靶點以及三陰性乳腺癌病理靶點進行整合，以確定潛在中藥治療三陰性乳腺癌的作用機制。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)獲取

通過TCGA數(shù)據(jù)庫(The cancer genome atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/)下載并處理乳腺癌原始的mRNA表達數(shù)據(jù)，并分離出三陰性乳腺癌表達譜，探討三陰性乳腺癌的差異基因，差異篩選條件為LogFC> 2 & adj.P<0.05。利用limma包對下載的mRNA level 3的FPKM數(shù)據(jù)進行整合和標準化，分析差異表達基因及其表達水平，差異基因篩選條件為 LogFC>2 &P<0.05。

1.3 篩選復(fù)方中藥治療三陰性乳腺癌的最佳靶點并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)

使用STRING在線數(shù)據(jù)庫11.0(https://string-db.org)對牛黃、麝香、乳香、沒藥抗三陰性乳腺癌作用靶點進行評估，并將置信度得分>0.4作為截點標準，得到一個靶-靶功能相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。此外，利用Cytoscape (version3.7.1) 中的Network Analyzer用于分析網(wǎng)絡(luò)中的拓撲參數(shù)，如中值degree和最大degree。進一步通過Cytoscape軟件可視化生成的PPI網(wǎng)絡(luò)，分析關(guān)鍵基因在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，探討疾病與基因表達的相關(guān)性。

1.4 GO和KEGG功能注析

利用R包“clusterprofiler”對核心靶點進行GO(gene oncology)富集和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，探討目標基因的功能相關(guān)性。p值和q值均小于0.05的GO和KEGG富集通路被認為是顯著性類別。

1.5 免疫細胞浸潤分析

采用CIBERSORT算法對三陰性乳腺癌患者RNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，用以推斷22種免疫浸潤細胞的相對比例，并對基因表達量以及免疫細胞含量進行spearman 相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R語言(version 3.6)進行統(tǒng)計分析，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三陰性乳腺癌靶點基因篩選

通過TCGA數(shù)據(jù)庫分選三陰性乳腺癌數(shù)據(jù)集，包括正常組113例、腫瘤組158例，分離出三陰性乳腺癌基因表達譜，共篩選出458個差異基因(圖1)，其中上調(diào)基因153個，下調(diào)基因305個。進一步通過OMIM數(shù)據(jù)庫以及GeneCards數(shù)據(jù)庫(Relevance score≥20)探討三陰性乳腺癌的相關(guān)靶點1973個，取差異基因與疾病數(shù)據(jù)庫交集基因131個。

注：a.TCGA數(shù)據(jù)庫篩選三陰性乳腺癌差異基因火山圖；b.TCGA數(shù)據(jù)庫篩選三陰性乳腺癌458個差異基因表達譜；c.OMIM數(shù)據(jù)庫與GeneCards數(shù)據(jù)庫差異基因交集圖1 三陰性乳腺癌差異基因篩選比較

2.2 西黃丸作用于三陰性乳腺癌關(guān)鍵基因分析

對TCMSP數(shù)據(jù)庫分別基于牛黃、麝香、乳香、沒藥這4種中藥獲取所含藥物有效成分以及有效成分所作用的靶點共301個，并使用Cytoscape通過網(wǎng)絡(luò)圖的形式展示中藥成分與靶點的作用關(guān)系(圖2)，再將藥物靶點與前者的131基因取交集，得到19個交集基因(圖3)。進一步通過單因素Cox和生存分析，篩選其中與腫瘤患者生存預(yù)后相關(guān)的基因，其中共識別4個關(guān)鍵基因，即CXC趨化因子配體10(Chemokine ligand-10，CXCL10)、腺病毒E2啟動子轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1，E2F1)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位(AP-1 transcription factor subunit，F(xiàn)OS)、凝血因子3(Coagulation factor III，F(xiàn)3)，其中CXCL10、E2F1是三陰性乳腺癌保護性因素，F(xiàn)OS、F3是三陰性乳腺癌預(yù)后危險因素(圖4)。

圖2 西黃丸組分牛黃、麝香、乳香、沒藥有效成分靶向分析

圖3 西黃丸藥物組分有效靶點與三陰性乳腺癌疾病靶點交集分析

注：a.CXCL10改善三陰性乳腺癌10年生存時間(p=0.015)；b.E2F1改善三陰性乳腺癌10年生存時間(p=0.014)；c.F3降低三陰性乳腺癌10年生存時間(p=0.010);FOS降低三陰性乳腺癌10年生存時間(p=0.026)圖4 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵基因生存預(yù)后分析

2.3 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌潛在網(wǎng)絡(luò)通路機制

GO 富集分析篩選得到GO條目25條 (P<0.05)，涉及生物過程10條，細胞組成6條，分子功能9條(圖5)。KEGG富集結(jié)果顯示，4個核心基因主要涉及通路11條，主要涉及為白介素-17(Interleukin-17, IL-17)、Toll樣受體(Toll-like receptor)和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)等信號通路(圖6)。

圖5 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵基因GO分析

圖6 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵基因KEGG分析

2.4 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌核心靶點通路交互分析

采用Cytoscape軟件，生成西黃丸抑制三陰性乳腺癌靶點的網(wǎng)絡(luò)可視化和核心靶點相關(guān)通路的交互圖，圖表能清晰地顯示西黃丸上調(diào)E2F1、CXCL10和下調(diào)FOS、F3的分子機制及其對三陰性乳腺癌的調(diào)控作用(圖7)。

圖7 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌核心靶點通路交互分析

2.5 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵靶點與腫瘤免疫細胞浸潤的關(guān)系

通過進一步探討西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌潛在的免疫學(xué)分子機制，研究結(jié)果表明，CXCL10與記憶T細胞活化正相關(guān)，與M2型巨噬細胞表達負相關(guān)；E2F1與濾泡型輔助T細胞(follicular helper T cell，Tfh)表達正相關(guān)，與靜止記憶T細胞負相關(guān)；F3與靜止樹突狀細胞(dendritic cell，DC)正相關(guān)，與Tfh表達負相關(guān)；FOS與靜止記憶T細胞正相關(guān)，與M0表型巨噬細胞表達負相關(guān)(圖8)，說明西黃丸可能是通過上調(diào)CXCL10、E2F1，下調(diào)F3、FOS從而抑制M2表型巨噬細胞，與促進Tfh細胞表達、DC細胞和記憶T細胞活化等機制有關(guān)。

a.CXCL10；b.B:E2F1；c.F3；d.FOS圖8 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵靶點與腫瘤免疫細胞浸潤的關(guān)系

3 討論

乳腺癌屬于中醫(yī)學(xué)“乳巖”“乳石癰”范疇，其病機為肝郁脾虛、氣血瘀滯、痰瘀毒聚發(fā)為乳巖，病屬本虛標實[3]。痰瘀凝聚經(jīng)絡(luò)是三陰性乳腺癌形成與進展的重要機制，活血化瘀化痰是三陰性乳腺癌的重要治法。

三陰性乳腺癌是臨床難治型乳腺癌亞型。本研究通過藥物靶點與疾病差異基因交集分析發(fā)現(xiàn)，西黃丸調(diào)控4個乳腺癌預(yù)后關(guān)鍵基因。其中CXCL10是趨化因子超家族中的1種，與相應(yīng)趨化因子受體結(jié)合，調(diào)控半胱天冬酶(caspase)家族等通路激酶，促進腫瘤細胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、血管生成。E2F1是細胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變的重要調(diào)節(jié)因子，磷酸化后可與DNA結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄過程。E2F1同時還可通過調(diào)控p53、p73、caspase家族等多種蛋白抑制腫瘤細胞抗凋亡途徑。Fos是原癌基因，是AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位，其基因編碼的亮氨酸拉鏈蛋白可以與JUN家族的蛋白二聚，從而形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1、FOS蛋白被認為是細胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)因子[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶通過多種途徑促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及血管新生F3生存分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3高表達與三陰性乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，而西黃丸可能通過降低F3的表達，從而影響三陰性乳腺癌的預(yù)后。

腫瘤微環(huán)境顯著影響著腫瘤的診斷、生存結(jié)局和臨床治療敏感性。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAMs)根據(jù)其功能不同，普遍將其分為M1型與M2型兩類[5]。通常認為，M2型巨噬細胞釋放CXCL家族趨化因子，IL-6、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[6]。分析結(jié)果提示，西黃丸的作用靶點可能與M2型巨噬細胞相關(guān)。記憶T細胞是T細胞中的重要亞群，在乳腺癌免疫應(yīng)答的啟動階段，CD4+記憶T細胞對CD8+T細胞衰竭有抑制作用[7]，而西黃丸作用于E2F1對記憶T細胞有潛在的調(diào)控作用。Tfh是一種特殊類型的輔助性T細胞，通過影響B(tài)細胞功能與遷移在非特異性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。在三陰性乳腺癌中，被免疫檢查點抑制劑激活的Tfh細胞可調(diào)節(jié)B細胞產(chǎn)生IgG抗體，這些抗體對免疫治療的療效至關(guān)重要。若抑制B細胞生成這些抗體，免疫治療效果就會嚴重受限。此外，CXCL10是腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化與自噬機制研究中的重要靶點，同時也是影響T細胞功能的重要分子[9]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，揭示了西黃丸在調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌關(guān)鍵靶點和腫瘤微環(huán)境中的潛在重要靶點，為中醫(yī)藥防治三陰性乳腺癌的臨床與機制研究提供了新思路，但其中具體的因子和細胞表達需要進一步的實驗印證。