李 益 馮秀秀 趙發(fā)珠 郭垚鑫 王 俊 任成杰

(1.陜西省地表系統(tǒng)與環(huán)境承載力重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西安 710127； 2.西北大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院 西安 710127； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 楊凌 712100； 4.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西安 710127)

土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)和養(yǎng)分循環(huán)的主要驅(qū)動力，直接影響著生物地球化學(xué)循環(huán)等重要生態(tài)過程(Kulhnkovetal., 2006； van der Heijdenetal., 2008)。以土壤微生物為主要內(nèi)容研究陸地生物地球化學(xué)循環(huán)過程與全球氣候變化的關(guān)系時(shí)，利用海拔梯度模擬氣候變化影響情景已成為近年來廣泛應(yīng)用的研究方法(李超男等, 2017)。尤其在森林生態(tài)系統(tǒng)中，沿海拔梯度變化的微生物特征及其與生物和非生物因子的響應(yīng)關(guān)系，可為探索環(huán)境梯度下的微生物多樣性格局提供認(rèn)識框架，從而為預(yù)測氣候變化驅(qū)動土壤微生物群落變化提供理論依據(jù)。

目前，關(guān)于土壤微生物多樣性隨海拔變化的規(guī)律并無統(tǒng)一定論(李超男等, 2017； 李桂香等, 2018)。如長白山森林土壤細(xì)菌多樣性并無明顯的海拔分布格局，但苔原帶土壤細(xì)菌多樣性隨海拔升高而顯著降低(Shenetal., 2013； 2015)。伊朗北部的赫卡尼亞森林中外生菌根真菌的多樣性隨海拔升高而單調(diào)下降(Bahrametal.， 2012)。也有研究表明土壤真菌多樣性隨海拔變化未表現(xiàn)出明顯規(guī)律性(Shenetal., 2014)或呈現(xiàn)出“空心(hollow)”的分布模式(Wangetal., 2016)。造成以上相異結(jié)果的原因可能是海拔梯度變化會影響植被類型，而不同植被可能通過凋落物及根系分泌物對土壤微生物群落產(chǎn)生影響(趙盼盼等, 2019)。王淼等(2014)在罕山的研究表明，不同海拔的植被類型差異顯著影響微生物群落的結(jié)構(gòu)組成(Bachetal., 2010)。趙盼盼等(2019)對黃山松(Pinustaiwanensis)林3個(gè)海拔梯度的研究表明，同一植被類型不同海拔的土壤微生物碳變化規(guī)律與不同植被類型海拔梯度的土壤微生物碳變化規(guī)律有所不同。然而，通過控制植被類型，在海拔梯度上對土壤微生物群落變化規(guī)律及驅(qū)動因子的認(rèn)識仍然有限，此方面的研究對深入理解和認(rèn)識森林生態(tài)系統(tǒng)的C、N、P等養(yǎng)分循環(huán)過程的微生物作用機(jī)制具有重要意義。

太白山為秦嶺山脈的最高峰，是中國氣候的南北分界線(張善紅等，2011)，也是中國重要的生態(tài)屏障，其北坡屬于典型的暖溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)。秦嶺山脈不僅對全球氣候變化非常敏感，而且具有典型的植被帶垂直分布特征(馬新萍等, 2017； 秦進(jìn)等, 2017)，是山地森林生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物垂直變化的天然研究平臺。銳齒櫟(Quercusalienavar.acuteserrata)林是秦嶺落葉闊葉林區(qū)的重要組分和典型植被，在我國北亞熱帶-暖溫帶過渡區(qū)森林土壤的固碳、水源涵養(yǎng)等方面具有重要作用(牛曉棟等, 2018)。以往研究多集中于大尺度海拔上的植物-土壤-微生物的相互作用，涉及多個(gè)植被類型。而本文為控制植被類型變化，僅選擇了作為太白山北坡典型植被的銳齒櫟林的土壤，利用Illumina測序技術(shù)，分析4個(gè)海拔梯度下的土壤微生物多樣性和群落組成的變化，以期闡明土壤微生物群落特征沿同一植被類型的不同海拔的垂直變化規(guī)律及主要驅(qū)動因素。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

太白山(33°45′—34°10′N，107°19′—107°58′E)研究區(qū)內(nèi)年降水量600～1 000 mm，主要集中在夏季。年均氣溫為5.9～7.5 ℃，北坡略低于南坡。研究區(qū)內(nèi)海拔1 060～3 771.2 m，沿海拔差異產(chǎn)生了氣候、土壤和生物種群的明顯的垂直分布帶。為控制植被類型變化，選擇分布在太白山北坡1 300～1 800 m的銳齒櫟林土壤進(jìn)行微生物研究，該地段屬典型的暖溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)，主要為棕壤(雷梅等, 2001)。

1.2 樣品采集與處理

2016年8月在太白山北坡海拔1 361.6、1 524.2、1 630.5和1 769.3 m處，分別選取地形、地貌、坡度和坡向基本一致的3個(gè)重復(fù)樣地(20 m×20 m)，各海拔森林樣地的銳齒櫟優(yōu)勢度分別為0.75、0.85、0.83和0.85。在每個(gè)樣地內(nèi)除去枯枝落葉層后，采用“S”型方法用直徑5 cm的土鉆收集表層(0～10 cm)土壤樣品10個(gè)，混勻后作為1個(gè)樣品，共收集12個(gè)混合土樣。將每個(gè)土樣過2 mm篩以去除植物根系和凋落物殘?bào)w，然后分為4份，其中1份立即測定土壤含水量，1份置于-80 ℃冰箱中用于土壤DNA分析，1份儲存在4 ℃冰箱中用于微生物生物量分析，剩余土樣于室溫下風(fēng)干后測定土壤的基本理化性質(zhì)。

1.3 土壤理化指標(biāo)測定

1.4 土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序

用Omega DNA試劑盒，從每個(gè)土樣(分成3份，每份0.5 g新鮮土壤，共計(jì)1.5 g)中提取土壤微生物DNA，然后用NanoDrop2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA)評估DNA的濃度和質(zhì)量。通過使用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCG CGG-3′)和907R(5′-CCGTC AATTCMTTTRAGTTT-3′)進(jìn)行靶向V4區(qū)的細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增(Ruiz-Gonzalezetal., 2015)。使用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)實(shí)現(xiàn)真菌ITS1區(qū)域的擴(kuò)增(Waltersetal., 2016)。將每個(gè)樣品擴(kuò)增3次，然后將相關(guān)的擴(kuò)增子混合以提供1種最終的PCR產(chǎn)物。同時(shí)，將16S rRNA和ITS rRNA的每個(gè)混合基因在2%瓊脂糖凝膠上電泳以改善PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和濃度。最后，將來自每個(gè)樣品的等量PCR產(chǎn)物置于單個(gè)管中，送至上海生物研究所于Illumina MiSeq平臺測序分析。

為使用QIIME對測序結(jié)果進(jìn)行多路分解、質(zhì)量過濾和處理(Caporasoetal., 2012)。首先，使用USEARCH v5.2.32進(jìn)行序列分析，通過聚類不相似性<3%的相似序列來過濾和消除來自數(shù)據(jù)的噪聲。其次，使用微生物生態(tài)學(xué)軟件(Microbial Ecology pipeline software)選擇16S rRNA和ITS rRNA操作分類單元(OTU)，將相似性大于97%的序列歸為同一種OTU(Caporasoetal., 2012)。最后，將完整的數(shù)據(jù)集與國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的序列儲存(SRA)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。細(xì)菌序列號為SRP223561，真菌序列號為SRP223559。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2013和SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)的預(yù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。用Origin 8.0軟件繪圖。單因素方差分析(one-way ANOVA)用于檢驗(yàn)不同海拔的土壤基本性質(zhì)、微生物生物量和群落組成的差異顯著性(P<0.05)。使用Mothur軟件(v.1.30.1)通過香農(nóng)(Shannon)指數(shù)估算微生物α多樣性；非度量多維尺度(NMDS)分析微生物β多樣性；回歸分析反映土壤微生物生物量與SOC和TN之間的關(guān)系。此外，用R(999個(gè)排列)中“vegan package”的相似性(ANOSIM)分析來評價(jià)海拔對細(xì)菌和真菌β多樣性的影響。采用Spearman相關(guān)分析確定土壤微生物多樣性與土壤性質(zhì)間的關(guān)系。利用CANOCO 5.0軟件進(jìn)行冗余分析(RDA)以確定土壤微生物群落組成與土壤性質(zhì)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)的海拔變化

表1 不同海拔梯度的銳齒櫟林土壤基本理化性質(zhì)①Tab.1 General characteristic of soils at different elevational gradients of Quercus aliena var. acuteserrata

圖1 微生物生物量(碳和氮)與土壤碳和氮之間的關(guān)系Fig. 1 Relationships between the microbial biomass (carbon and nitrogen) and the carbon and nitrogen in soilMBC： 微生物生物量碳Microbial biomass carbon； MBN： 微生物生物量氮Microbial biomass nitrogen. MBC與SOC呈正相關(guān)但無顯著相關(guān)性(P = 0.089 1); MBN與TN呈顯著正相關(guān)(y = 0.047 0x-4.136 4, R2 = 0.998 3, P = 0.025 9)。MBC was positively but not significantly correlated with SOC(P=0.089 1); MBN was positively and significantly correlated with TN(y = 0.047 0x-4.136 4, R2 = 0.998 3, P = 0.025 9).

2.2 土壤微生物多樣性的海拔變化

隨海拔升高，細(xì)菌和真菌的α多樣性(香農(nóng)指數(shù))均表現(xiàn)出先增后減的趨勢(圖2)，且細(xì)菌α多樣性變化極顯著(P< 0.01)，而真菌α多樣性在不同海拔間無顯著差異(P= 0.818)。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在海拔相近樣地可聚集為一類(圖3)，即歸納為3個(gè)類群： 海拔1 361.1 m的低海拔類群、海拔1 524.2 m的中海拔類群及海拔1 630.5和1 769.3 m的較高海拔類群。而土壤真菌β多樣性在不同海拔間無明顯聚集模式。通過ANOSIM分析發(fā)現(xiàn)，海拔對細(xì)菌β多樣性的影響(ANOSIM，R=0.648，P= 0.001)大于對真菌β多樣性的影響(ANOSIM，R=0.142，P=0.128)。

圖2 土壤細(xì)菌和真菌α多樣性(香農(nóng)指數(shù)) 沿海拔的變化Fig. 2 Changes of bacterial and fungal α diversity(Shannon index) along the elevational gradients不同字母表示差異顯著(P<0.05)。 下同。Different letters mean significant difference at 0.05 level. The same below.

圖3 銳齒櫟林土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)β多樣性沿海拔的變化Fig. 3 Changes of soil bacterial(A) and fungal(B) β diversity along the elevational gradients of Q. aliena var. acuteserrata

2.3 土壤微生物群落組成的海拔變化

由圖4A可知，細(xì)菌群落組成，相對豐度>1%的優(yōu)勢菌門是酸桿菌(Acidobacteria)(41.8%)、變形菌(Proteobacteria)(24.9%)、放線菌(Actinobacteria)(14.1%)、綠彎菌(Chloroflexi)(5.4%)、芽單胞菌(Gemmatimonadetes)(4.3%)、硝化螺旋菌(Nitrospirae)(2.3%)、疣微菌(Verrucomicrobia)(2.0%)和浮霉菌(Planctomycetes)(1.8%)。其中，酸桿菌、放線菌和浮霉菌的豐度隨海拔升高而下降，但僅放線菌下降顯著(P< 0.05)； 變形菌和疣微菌隨海拔升高而顯著增加(P< 0.05)； 綠彎菌、芽單胞菌和硝化螺旋菌隨海拔升高先增后減； 其他的細(xì)菌門(包括未知的分類群)占總細(xì)菌類別的3.4%，且整體隨海拔升高無顯著差異。此外，在細(xì)菌的綱類水平上，變形菌的分支α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)占主導(dǎo)地位(14.47%)，且隨海拔升高而極顯著增加(22.67%～28.69%，P<0.01)，但另外3個(gè)變形菌的分支，即β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)隨海拔的升高無明顯變化規(guī)律(P>0.05)。在細(xì)菌的目類水平上，酸桿菌目(Acidobacteriales)、索利氏菌目(Solibacteriales)、紅螺菌目(Rhodospirillales)和根瘤菌目(Rhizobiales)最豐富，但隨海拔升高變化不顯著(P>0.05)。

由圖4B可知，真菌群落組成，相對豐度>1%的優(yōu)勢菌門是擔(dān)子菌(Basidiomycota)(81.5%)和子囊菌(Ascomycota)(17.5%)。隨海拔升高，擔(dān)子菌的豐度總體呈下降趨勢，而子囊菌總體呈增加趨勢，但二者變化均不顯著。分類學(xué)分析(表2)表明，傘菌綱(Agaricomycetes)，即擔(dān)子菌的分支，是最豐富的真菌綱，占真菌綱類水平的80%以上，但其隨海拔升高變化不顯著(P>0.05)； 傘菌目(Agaricales)、紅菇目(Russulales)和雞油菌目(Cantharellales)占真菌目類水平的60%以上，且隨海拔升高無顯著差異(P>0.05)?？傮w而言，海拔對真菌類群的各分類水平(門、綱、目)的影響小于細(xì)菌。

圖4 不同海拔梯度銳齒櫟林土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)群落組成在門水平上的相對豐度Fig. 4 Relative abundance of the soil bacterial(A) and fungal(B) communities at the phylum level in different elevational gradients of Q. aliena var. acuteserrataAcid: 酸桿菌 Acidobacteria; Prot: 變形菌 Proteobacteria; Acti: 放線菌 Actinobacteria; Chlo: 綠彎菌 Chloroflexi; Gemm:芽單胞菌 Gemmatimonadetes; Nitr: 硝化螺旋菌 Nitrospirae; Plan: 浮霉菌 Planctomycetes; Verr: 疣微菌 Verrucomicrobia; Basi: 擔(dān)子菌 Basidiomycota; Asco: 子囊菌 Ascomycota. 下同。 The same below.

2.4 土壤微生物多樣性和群落組成與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

Spearman相關(guān)性分析可知，細(xì)菌α多樣性與SOC和C∶P顯著正相關(guān)，而真菌α多樣性僅與SM呈顯著負(fù)相關(guān)； 細(xì)菌β多樣性(Bray-Curtis Distance)與SOC、TN、TP、C∶P、N∶P和BD顯著正相關(guān)，而真菌β多樣性與所測土壤性質(zhì)均無顯著相關(guān)(表2)。

RDA分析表明，細(xì)菌門類水平中除酸桿菌、硝化螺旋菌和浮霉菌與土壤性質(zhì)未呈現(xiàn)顯著相關(guān)性以外，其余菌門均與土壤性質(zhì)顯著相關(guān)(圖5A)。其中，BD與變形菌和疣微菌呈顯著負(fù)相關(guān)，而與放線菌呈顯著正相關(guān)； 芽單胞菌隨海拔的變化與SOC和C∶P密切相關(guān)。在細(xì)菌的綱類和目類水平上，酸桿菌的分支嗜酸桿菌綱(Acidobacteriia)與SOC和C∶P呈顯著負(fù)相關(guān)，酸桿菌目與SOC、TN和C∶P呈顯著負(fù)相關(guān)； 變形菌的分支α-變形菌綱(在變形菌門中占比最大)與BD呈顯著負(fù)相關(guān)，γ-變形菌綱與TN、MBN、N∶P和MBC∶MBN呈顯著相關(guān)(圖5C、E)。

對真菌門類水平，由圖5B可知，土壤性質(zhì)在門類水平上與真菌群落關(guān)系不大； 而在真菌的綱類水平中，除傘菌綱(Agaricomycetes)和錘舌菌綱(Leotiomycetes)，其余真菌綱均與SOC、TN和N∶P表現(xiàn)出一定的顯著相關(guān)性(圖5D)； 在真菌的目類水平中，土壤性質(zhì)對傘菌目、紅菇目(Russulales)、糞殼目(Sordariales)和肉座目(Hypocreales)的影響不顯著，僅銀合歡目(Agyriales)與SOC、TN和N∶P顯著負(fù)相關(guān)(圖5F)?？傊?，BD、ST、SOC、C∶P和TN極顯著地影響了細(xì)菌群落組成，而pH、SOC、TN和N∶P對土壤真菌群落組成有較大影響。

3 討論

3.1 銳齒櫟林土壤微生物多樣性沿海拔變化的差異性

本研究表明，在一定的海拔范圍內(nèi)，細(xì)菌和真菌的α多樣性隨海拔升高均呈先增后減的變化趨勢，這與SOC、TN、TP、C∶P和N∶P沿海拔的變化趨勢一致(圖2)，說明同一植被類型中沿海拔梯度的土壤養(yǎng)分含量對微生物群落起著重要作用，是決定微生物生存、物種組成和代謝的關(guān)鍵因素(趙盼盼等, 2019)。NMDS分析表明，細(xì)菌β多樣性有明顯的海拔分布格局，而真菌β多樣性隨海拔升高未呈現(xiàn)規(guī)律性變化(圖3)。這與Meng等(2013)在中國亞熱帶山地森林中研究土壤微生物海拔變化的結(jié)果類似；但與Bahram等(2012)在伊朗北部研究的赫卡尼亞森林的海拔梯度變化結(jié)果有差異，這可能是本研究為同一植被類型且海拔梯度帶來的溫度差異較小，而Bahram等(2012)的研究選擇的是不同植被類型且溫度差異較大。然而，本研究中真菌β多樣性對土壤理化特性的響應(yīng)與Wang等(2015)對西藏森林的海拔變化研究結(jié)果有所不同，其原因可能是本研究為同一植被類型在有限海拔范圍(1 361～1 769 m)的變化，而在西藏的研究跨越的海拔范圍大(3 351～4 477 m)從而涉及不同植被類型，不同植被類型可通過植物根系的機(jī)械作用差異對土壤物理特性產(chǎn)生不同影響，也可借助根系分泌物和凋落物等的不同對土壤微生物活性產(chǎn)生不同的直接或間接影響，進(jìn)而導(dǎo)致土壤微生物群落的變化(Lucasetal., 1993)。

3.2 銳齒櫟林土壤微生物群落組成沿海拔的變化及驅(qū)動因子

本研究表明，細(xì)菌的優(yōu)勢菌門酸桿菌和浮霉菌在不同海拔間無顯著差異。與本研究不同，賀婧等(2019)在秦嶺太白山大尺度范圍內(nèi)對7個(gè)植被類型(海拔范圍800～3 760 m)的研究表明，土壤細(xì)菌隨海拔升高均有顯著變化。這可能是本研究的海拔范圍內(nèi)的土壤水分海拔差異較小，不足以引起二者的豐度顯著變化。另外，大多研究表明酸桿菌是寡營養(yǎng)型菌(Kielaketal., 2009； Naetheretal., 2012； Zhangetal., 2014)，可能對環(huán)境變化的耐受性較強(qiáng)。對真菌群落組成，隨海拔升高，擔(dān)子菌總體呈下降趨勢，而子囊菌總體呈增加趨勢，但二者變化均不顯著(圖4)。Ren等(2018)通過研究秦嶺太白山大尺度海拔范圍內(nèi)(1 300～2 600 m)的4個(gè)植被類型的土壤真菌，與本研究結(jié)果不一致，即隨海拔增加出現(xiàn)先增后減再增加的變化，其原因可能是不同植被帶中植物的凋落物與根系分泌物差異較大，且海拔梯度導(dǎo)致的溫度、水分等多種因素之間的緊密聯(lián)系存在復(fù)雜影響機(jī)制(Xuetal., 2017)，對土壤真菌群落造成不同影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨海拔增加變形菌受土壤密度(BD)的顯著影響(圖5)，γ-變形菌綱與全氮(TN)、微生物生物量氮(MBN)、N∶P和微生物生物量碳(MBC)∶MBN呈顯著相關(guān)，且放線菌與土壤養(yǎng)分[如土壤有機(jī)碳(SOC)、TN、全磷(TP)、MBC、MBN、C∶P和N∶P]含量均呈負(fù)相關(guān)(圖5C)，說明在一定的海拔范圍內(nèi)，土壤理化性質(zhì)對土壤微生物群落組成的影響比海拔或氣候的影響更顯著(Silesetal., 2016； Stroobantsetal., 2014)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)真菌主要的優(yōu)勢菌門擔(dān)子菌和子囊菌僅受土壤pH值的顯著影響(圖5B)，這與前人研究結(jié)果類似，如Meng等(2013)認(rèn)為子囊菌與pH值顯著相關(guān)； Moreira Neto等(2009)認(rèn)為，pH值是影響擔(dān)子菌產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶活性的重要因素。上述結(jié)果不僅說明一定海拔范圍內(nèi)的土壤特性(BD、ST、SOC、C∶P、pH和TN)變化是導(dǎo)致土壤細(xì)菌和真菌群落組成發(fā)生顯著變化的主要原因，且進(jìn)一步說明相比植物養(yǎng)分含量和土壤水熱條件，土壤特性對微生物群落組成的影響更強(qiáng)烈。趙盼盼等(2019)在中亞熱帶戴云山的3個(gè)海拔(1 300、1 450、1 600 m) 的黃山松林研究表明，SOC、TN、TP、MBN、MBP和細(xì)菌、真菌生物量均隨海拔升高而顯著下降。因此，在減弱因海拔大范圍變化所引起的多個(gè)因素變化的影響后，土壤特性對有限海拔范圍內(nèi)的微生物變化起到了主導(dǎo)作用。本研究中MBC與SOC無顯著相關(guān)性，這與Michelsen等(1999)的研究結(jié)果不同，這可能是由于采樣過程中及微生物保存過程中的不確定性造成的。

總之，土壤細(xì)菌和真菌多樣性和群落組成的海拔差異會因海拔變化范圍大小不同而存在差異，且具有不同的響應(yīng)過程。本研究僅針對一定海拔范圍內(nèi)的森林土壤微生物群落的變化特征，還需進(jìn)一步研究揭示這種差異的關(guān)鍵驅(qū)動因素及作用機(jī)制。

4 結(jié)論

1) 在秦嶺太白山的一定海拔范圍(1 361.6～1 769.3 m)內(nèi)，銳齒櫟林土壤細(xì)菌和真菌的α多樣性隨海拔升高呈先增后減的單峰變化。細(xì)菌α多樣性的海拔變化主要與SOC和C∶P的海拔變化相關(guān)，而真菌的α多樣性海拔變化只與SM的海拔變化顯著相關(guān)。

2) 土壤細(xì)菌的β多樣性具有一定的海拔變化規(guī)律性，且主要與SOC、TN、TP、C∶P、N∶P和BD的海拔變化有關(guān)，但真菌的β多樣性沿海拔變化的規(guī)律不明顯。

3) RDA分析表明，在限定的海拔范圍內(nèi)，土壤BD、ST、SOC、C∶P和TN的變化是影響土壤細(xì)菌群落組成顯著變化的主要原因，而其對真菌群落的影響較小。