匡雙便 ，張 鐵 ，曾文波 ，田迎秋 ，張月嬌 ，高麗芳 ，楊本恒

（1.文山學(xué)院 三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663099；2.文山學(xué)院 文山州生物資源開發(fā)研究中心，云南 文山 663099；3.文山學(xué)院 文山三七研究院，云南 文山 663099）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl. et Hemsl.）首載于《植物名實圖考》[1]，為百合科黃精屬多年生草本植物，又名節(jié)節(jié)高、仙人飯（云南），為中藥黃精的3個基原品種（黃精、滇黃精、多花黃精）之一[2]，主要分布在云南，是滇西北高海拔地區(qū)適生、常見藥用植物類群[3]，我國廣西、貴州、四川部分地區(qū)以及國外越南和緬甸也有分布[4-5]。滇黃精是我國傳統(tǒng)補益類中藥材[6]，是集藥用價值、食用價值、保健和觀賞于一身的植物，經(jīng)濟價值較高，具有廣闊的市場開發(fā)前景。滇黃精藥用和食用部位為根狀莖，滇黃精化學(xué)成分多樣，含有黃精多糖、甾體皂苷、類黃酮等活性物質(zhì)，還含有生物堿、木脂素類化合物、蒽醌類化合物及多種人體必需的氨基酸和微量元素[7-9]，藥理活性廣泛，具有多種生物活性和保健功能，對滇黃精的各種成分進行提取、分離后，可研制成增強機體免疫功能、抗衰老、降血糖、降血脂、抗疲勞、耐缺氧等作用的功能性藥品和保健食品，在臨床上用于治療糖尿病、冠心病、高脂血癥、肺結(jié)核、淋巴結(jié)核、白細胞減少、腹瀉、便秘、失眠等多種疾病。另外，滇黃精含有多種天然美容活性成分，具有抗衰老、防輻射、抗炎、抗菌、生發(fā)烏發(fā)、固齒等美容功能[10]。

近年來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，生活水平的不斷提高，人們越來越重視健康養(yǎng)生，對滇黃精的多種功能也進行了深入的研究，以滇黃精為原料的各種功能的保健食品、藥品不斷被研制出來，滇黃精的市場需求量急劇上升，人們?nèi)ド缴喜赏诹縿≡?，滇黃精野生資源越來越少。滇黃精是云南的道地藥材之一，具有比較顯著的資源優(yōu)勢，市場開發(fā)潛力巨大。因此，開展人工栽培，對緩解野生滇黃精資源采集壓力、保持野生滇黃精種質(zhì)資源的多樣性以滿足市場的需求具有重大意義。滇黃精有兩種傳統(tǒng)繁殖方法，一種是通過種子進行繁殖，另一種是通過營養(yǎng)器官進行繁殖。在自然條件下，黃精種子難以收集，播種育苗周期長，從播種到成苗需要1年的時間，且存在出苗率低和后代性狀分化嚴重等問題。根狀莖繁殖則存在需要大量黃精繁殖材料、繁殖率低和多次繁殖容易積累病毒以及品種退化等風(fēng)險。因此，這兩種繁殖方法均不利于滇黃精規(guī)?；N植。組織培養(yǎng)既能實現(xiàn)快速大量繁殖，又能較好地保持母本優(yōu)良性狀，而且不受季節(jié)、環(huán)境、取材等因素的制約，是實現(xiàn)滇黃精工廠化育苗和加快良種推廣應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。

前人對滇黃精的組織培養(yǎng)研究較多，滇黃精的根狀莖、葉、花藥、嫩芽、種子均可作為外植體[8-11]。但不同的研究人員所選用激素的種類、劑量和組合不一樣，并且研究結(jié)果也不盡相同。因此，本研究以無菌組培苗的不同器官組織為材料，采用正交試驗的方法對愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以提高愈傷組織誘導(dǎo)率及其品質(zhì)，為滇黃精種苗快速繁育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以文山學(xué)院生物資源開發(fā)研究中心實驗室保存的滇黃精無菌組培苗作為材料，選用長勢良好、大小近似的滇黃精組培苗的嫩葉、葉柄、根狀莖進行培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加2,4-D、6-BA和KT 等植物生長調(diào)節(jié)劑，激素質(zhì)量濃度設(shè)置見表1，試驗采用L9（33）正交設(shè)計。培養(yǎng)基中添加的蔗糖濃度為30 g/L，卡拉膠6.5 g/L，pH調(diào)至5.8。

表1 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA、 KT 和 2,4-D濃度的L9 (33)因素水平

1.2.2 接種方法

選取大小一致、優(yōu)質(zhì)的滇黃精組培苗，在超凈工作臺中將根狀莖和葉片切成0.5 cm× 0.5 cm小塊、葉柄切成0.6 cm長的小段，分別接種于不同配方的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)，每組培養(yǎng)基接10瓶，每瓶接種5個外植體，重復(fù)3次。每隔15 d觀察并記錄一次生長情況，并清除污染的材料，培養(yǎng)45 d之后統(tǒng)計愈傷組織數(shù)、長勢情況等。

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=（形成愈傷組織數(shù)/接種數(shù)）×100%。

1.2.3 培養(yǎng)條件

前4周為暗培養(yǎng)，之后進行光暗交替培養(yǎng)，光照強度為2 500 Lx，光照時間為10 h/d，培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS18.0軟件進行相關(guān)處理及顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

從表2可以得出，在本試驗設(shè)置的激素濃度中，葉片沒有長出愈傷組織，培養(yǎng)15 d后有的有不規(guī)則的卷曲（見圖1），處理A1B3C3和A2B1C2即MS+6-BA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+2,4-D 1.5mg/L和MS+6-BA 1mg/L+2,4-D 1mg/L培養(yǎng)45 d后葉片仍然是綠色的，和剛接進去時顏色相差不大，其余處理都不同程度地發(fā)黃或者褐變；葉柄有部分長出愈傷，但長愈傷的數(shù)量不多，有的在培養(yǎng)過程中有一頭膨大的，有兩頭膨大的（見圖2）；根狀莖基本都長出愈傷，CK中沒有添加激素誘導(dǎo)出部分愈傷，并且大多數(shù)長芽和長根，有激素的處理只長芽，沒有長根（見圖3～圖4）。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對根狀莖、葉柄、葉片愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果比較

圖 1 嫩葉培養(yǎng)15 d后出現(xiàn)不規(guī)則卷曲

圖 2 葉柄長出愈傷及膨大現(xiàn)象

圖 3 添加激素的根狀莖長芽不長根

圖 4 CK沒有添加激素根狀莖長芽并且長根

經(jīng)過培養(yǎng)15 d，滇黃精葉柄開始長出愈傷，并且隨時間的延長，愈傷組織進一步增多。45 d后統(tǒng)計各處理的愈傷生長情況并進行評價，結(jié)果見表3。直觀分析結(jié)果顯示，影響滇黃精葉柄愈傷組織因素的主次順序為：B(KT) ＞ C(2,4-D) ＞ A(6-BA)，滇黃精葉柄愈傷組織誘導(dǎo)最好的為A3B2C1，即MS+6-BA 1.5 mg/L+ KT 0.25 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率達28.9%，且愈傷組織質(zhì)量最好。A3B2C1愈傷誘導(dǎo)率與其余處理差異性顯著，其次為A1B2C2和A2B1C2愈傷組織誘導(dǎo)率為17.8%，顯著高于對照，其他處理水平與CK相比差異不顯著。

表3 植物生長調(diào)節(jié)劑對滇黃精葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

經(jīng)過培養(yǎng)15 d，滇黃精根狀莖開始長出愈傷，并且隨時間的延長，愈傷組織進一步增多。45 d后統(tǒng)計各處理的愈傷生長情況進行評價，結(jié)果見表4。直觀分析結(jié)果顯示，影響滇黃精塊根愈傷組織因素的主次順序為：B(KT) ＞ C(2,4-D) ＞ A(6-BA)，滇黃精塊根愈傷組織誘導(dǎo)最好的為A2B1C2，即MS+6-BA 1.5 mg/L+ 2,4-D 1 mg/L，誘導(dǎo)率達93.3%，且愈傷組織質(zhì)量最好（見圖5）；其次為A1B3C3即MS+6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L+2,4-D 1.5 mg/L誘導(dǎo)率達88.9%，并且與對照相比差異都非常顯著。

表4 植物生長調(diào)節(jié)劑對滇黃精根狀莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖 5 培養(yǎng)基A2B1C2根狀莖愈傷組織

3 討論與結(jié)論

有研究表明，滇黃精的根狀莖、葉、花藥、根莖、嫩芽、種子均可作為外植體[11-14]，但誘導(dǎo)出愈傷組織的難易程度不同。李鶯等研究發(fā)現(xiàn)，黃精根莖及地上嫩莖較葉片更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，而葉片不適宜誘導(dǎo)愈傷組織[15]；裴莉昕等的研究表明，黃精嫩葉為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體[16]；楊玉紅的研究則表明，葉片和地上莖沒有誘導(dǎo)出愈傷組織，只有根狀莖誘導(dǎo)產(chǎn)生了愈傷組織[17]。本研究中以滇黃精無菌組培苗的根狀莖、葉柄和嫩葉作為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)愈傷組織的最佳的外植體為根狀莖，其次為葉柄，嫩葉沒有誘導(dǎo)出愈傷組織，研究結(jié)果和李鶯和楊玉紅等人的結(jié)果相似。

有研究表明，6-BA對黃精愈傷組織生長有顯著效果，2,4 -D、NAA 和KT 效果不顯著：林海和郝慧敏的研究表明，培養(yǎng)基MS +6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.25 mg/L +KT 3 mg/L +2,4-D 0.25 mg/L為誘導(dǎo)黃精愈傷組織的最適合的培養(yǎng)基[18]；楊紅玉則發(fā)現(xiàn)MS +2,4-D 3.0 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L + KT 0.25 mg/L為誘導(dǎo)黃精愈傷組織的最適培養(yǎng)基[17]；萬學(xué)鋒等認為6-BA比其他細胞分裂素更有利于多花黃精的分化[19]。葉心雨等的研究表明，KT對多花黃精愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著影響，6-BA對多花黃精愈傷組織的誘導(dǎo)作用不顯著，但6-BA與2,4-D等生長調(diào)節(jié)劑配合使用有一定的促進效果[20]。徐紅梅將多花黃精莖尖切片在MS+BA1 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L培養(yǎng)基下誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織分化后產(chǎn)生新植株[21]。陳松樹等[22]以多花黃精的葉片為外植體，得出愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 4.0 mg/L+蔗糖20 g/L。本研究中根狀莖和葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基與前人的研究結(jié)果存在較大差異，且不同器官最適合的配方也不同，由于不同種類的外植體基因型、生長環(huán)境、分化程度、生理狀態(tài)、內(nèi)源激素含量等差異，可能導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)所需植物生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度及組合存在較大差異，且后續(xù)的器官發(fā)生對同一植物生長調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)是不同的。

本研究結(jié)果表明：誘導(dǎo)出愈率依次為根狀莖＞葉柄＞葉片；激素因素的主次順序為：B(KT) ＞ C(2,4-D) ＞ A(6-BA)；最適宜滇黃精根狀莖愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為：MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-D 1mg/L，誘導(dǎo)率達93.3%，且愈傷組織質(zhì)量最好；滇黃精葉柄愈傷組織誘導(dǎo)最適宜的培養(yǎng)基為MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+ KT 0.25mg/L，誘導(dǎo)率達28.9%，且愈傷組織質(zhì)量最好。