陳 威,譚敏華,周泳健,黃文彥,李 玲,安建虹,申 洪

(1.肇慶市第一人民醫(yī)院 病理科,肇慶 526060;2.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣州 510060;3.南方醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,廣州 510515)

0 引言

宮頸癌與HPV(human papilloma virus, HPV)感染關(guān)系密切[1]。從感染HPV到宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及癌變伴隨宮頸上皮細(xì)胞DNA倍體改變。因此,DNA倍體改變可反映CIN及癌變[2]。目前,CIN及癌變的篩查主要采用宮頸細(xì)胞學(xué)涂片巴氏染色和液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，DNA倍體檢測(cè)在篩查中的價(jià)值尚存爭(zhēng)議[3]，是否值得采用DNA倍體分析方法進(jìn)行宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變的細(xì)胞學(xué)篩查及細(xì)胞學(xué)診斷，尚需科學(xué)分析和評(píng)價(jià)。為此，本文對(duì)宮頸脫落細(xì)胞DNA倍體檢測(cè)方法在CIN及癌變篩查中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用時(shí)的選擇提供參考。為避免樣本構(gòu)成因素對(duì)診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果中的準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)告值和陰性預(yù)告值的影響，本文增加了新的評(píng)價(jià)指標(biāo)(包括標(biāo)準(zhǔn)化準(zhǔn)確度(SAc，standardized accuracy)、標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性預(yù)告值(SPPV，standardized positive predictive value)和標(biāo)準(zhǔn)化陰性預(yù)告值(SNPV，standardized negative predictive value)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 病例

源自肇慶市第一人民醫(yī)院,2018年3月至2020年3月期間行宮頸脫落細(xì)胞DNA倍體定量分析的10 766例病例。按照診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)設(shè)計(jì)要求,從中篩選出同時(shí)進(jìn)行了病理活檢診斷的病例，共1113例。年齡19～77歲，平均年齡42.1±10.3歲。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理

由婦科醫(yī)師采集受檢者宮頸脫落細(xì)胞，連同采樣刷頭一同置于盛有保存液的標(biāo)本瓶中，病理科制備液基薄層涂片。

1.2.2 DNA倍體定量檢測(cè)分析

對(duì)上述液基薄層細(xì)胞涂片行Feulgen染色，用全自動(dòng)DNA倍體分析系統(tǒng)(武漢呵爾醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)定量測(cè)試涂片內(nèi)所有細(xì)胞核的DNA倍體[4]。判讀標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)DNA指數(shù)(DI，DNA index)<2.5，定義為異倍體陰性，記作：DNA異倍體(-)，即涂片中異倍體細(xì)胞=0個(gè)；當(dāng)DI≥2.5，定義為異倍體陽(yáng)性，記作：DNA異倍體(+)，即涂片中異倍體細(xì)胞≥1個(gè)，其中當(dāng)異倍體細(xì)胞為1～2個(gè)時(shí)，記作：異倍體(1+)；當(dāng)異倍體細(xì)胞≥3個(gè)時(shí)，記作：異倍體(2+)。

1.2.3 診斷金標(biāo)準(zhǔn)及分組

婦產(chǎn)科醫(yī)生對(duì)異倍體(+)的病例行陰道鏡檢查并在宮頸可疑病變部位行4個(gè)以上組織位點(diǎn)的活檢。本研究異倍體(+)或(-)并行宮頸病理活檢診斷的病例分別為863和250例，合計(jì)1113例。

根據(jù)活檢結(jié)果，宮頸病變被分為CIN陰性(宮頸普通慢性炎癥)、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和癌變。為了表述簡(jiǎn)捷，本文用“CIN”泛指CINⅠ-Ⅲ，用“CINⅠ及以上”泛指CINⅠ-Ⅲ及癌變，用“CINⅡ及以上”泛指CINⅡ-Ⅲ及癌變，用“CIN及以下”泛指CINⅠ-Ⅲ及CIN陰性，以此類推。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以病理活檢診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，按照診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法(表1)[4-5]，分別計(jì)算異倍體(+)，包括了(1+)和(2+)，以及單獨(dú)(2+)時(shí)對(duì)篩查CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和癌的靈敏度(Se，sensitivity)、特異度(Sp，specificity)、準(zhǔn)確度(Ac，accuracy)、標(biāo)化準(zhǔn)確度(SAc)、陽(yáng)性預(yù)告值(PPV，positive predictive value)、標(biāo)化陽(yáng)性預(yù)告值(SPPV)、陰性預(yù)告值(NPV，negative predictive value)和標(biāo)化陰性預(yù)告值(SNPV)[5-8]，具體計(jì)算公式如表1 所示。

表1 診斷試驗(yàn)分析評(píng)價(jià)模式

(1)

(2)

(3)

SAc=(Se+Sp)/2

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

2 結(jié)果

2.1 1113例患者宮頸細(xì)胞DNA倍體測(cè)試與宮頸活檢病理診斷基本結(jié)果

①宮頸DNA異倍體(+，圖1a)并行病理活檢共863例，其中CINⅠ(圖1b)127例，CINⅡ(圖1c)和Ⅲ(圖1d)229例，癌21例(包括鱗癌19例，圖1e；腺癌2例，圖1f)，CIN陰性486例；②異倍體(2+)并活檢395例，其中CINⅠ78例，CINⅡ和Ⅲ共208例，癌19例，病理活檢CIN陰性90例；③DNA異倍體(-)并活檢250例，其中CINⅠ16例，CINⅡ和Ⅲ共2例，病理活檢CIN陰性232例。具體檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

圖1 DNA倍體異常及其對(duì)應(yīng)活檢陽(yáng)性病例圖示a.DNA異倍體(+)，F(xiàn)eulgen染色示細(xì)胞核增大，染色質(zhì)增粗，呈紫藍(lán)色；b.CINⅠ，鱗狀上皮層內(nèi)1/3不典型增生，并見(jiàn)挖空細(xì)胞；c.CINⅡ，不典型增生細(xì)胞超過(guò)鱗狀上皮內(nèi)1/3，未超過(guò)內(nèi)2/3；d.CINⅢ，不典型增生細(xì)胞累及鱗狀上皮全層；e.宮頸鱗狀細(xì)胞癌(中分化)，異型鱗狀上皮突破上皮，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)；f.宮頸腺癌(高分化)，異型腺上皮呈不規(guī)則腺樣，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。放大倍數(shù)及染色：圖a、d為物鏡40×; b、c、e、f為物鏡20×；b、c、d、e和f為HE染色。

表2 宮頸細(xì)胞DNA倍體定量測(cè)試結(jié)果與宮頸活檢病理檢查結(jié)果

2.2 基于異倍體(+)篩查CIN及癌變的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

以異倍體(+)為標(biāo)準(zhǔn)，包括(1+)和(2+)，篩查CIN及癌變，異倍體(+)病例中活檢診斷CIN及癌變共377例，陰性486例；異倍體(-)病例中活檢診斷CIN及癌變18例，陰性232例。篩查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分別為：95.4%、32.3%、54.7%、63.9%、43.7%、58.5%、92.8%和87.5%，如表3所示。

表3 基于異倍體(+)篩查CIN及癌變的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 基于異倍體(+)篩查CINⅡ、Ⅲ及癌變的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

以異倍體(+)為標(biāo)準(zhǔn)，包括(1+)和(2+)，篩查CINⅡ、Ⅲ及癌變，異倍體(+)病例中活檢診斷CINⅡ、Ⅲ及癌變共250例，CINⅠ及陰性共613例；異倍體(-)病例中活檢診斷CINⅡ和Ⅲ 2例，CINⅠ及陰性共248例。篩查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分別為：99.2%、28.8%、44.7%、64.0%、29.0%、58.2%、99.2%和97.3%，如表4所示。

表4 基于異倍體(+)篩查CINⅡ及以上病變(包括癌變)的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4 基于異倍體(+)篩查宮頸癌的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

以異倍體(+)為標(biāo)準(zhǔn)，包括(1+)和(2+)，篩查宮頸癌，異倍體(+)病例中活檢診斷鱗癌共21例，CINⅠ-Ⅲ及陰性842例；異倍體(-)病例中癌0例，CINⅠ-Ⅲ及陰性250例。篩查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分別為:100%、22.9%、24.3%、61.5%、2.4%、56.5%、100%和100%，如表5所示。

表5 基于異倍體(+)篩查宮頸癌的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)

2.5 基于異倍體(2+)篩查CIN和癌變的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

以異倍體(2+)為標(biāo)準(zhǔn)篩查CIN和癌變，異倍體(2+)病例中活檢診斷CIN和癌變共305例，陰性90例；異倍體(1+)及(-)病例中診斷CIN和癌變共90例，陰性628例。篩查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分別為：77.2%、87.5%、83.8%、82.4%、77.2%、86.1%、87.5%和79.3%，如表6所示。

表6 基于異倍體(2+)篩查CIN和癌變的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 基于異倍體(2+)篩查CINⅡ、Ⅲ及癌變的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

以異倍體(2+)為標(biāo)準(zhǔn)篩查CINⅡ、Ⅲ及癌變，異倍體(2+)病例中活檢診斷CINⅡ、Ⅲ及癌變227例，CINⅠ及以下病變168例；異倍體(1+)及(-)病例中診斷CINⅡ、Ⅲ及癌變25例，CINⅠ及以下病變693例。篩查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分別為:90.1%、80.5%、82.7%、85.3%、57.5%、82.2%、96.5%和89.0%，如表7所示。

表7 基于異倍體(2+)篩查CINⅡ、Ⅲ及癌變的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.7 基于異倍體(2+)篩查宮頸癌的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果

以異倍體(2+)為標(biāo)準(zhǔn)篩查宮頸癌，異倍體(2+)病例中活檢診斷宮頸癌共19例，CINⅢ及以下病變(包括陰性)共376例；異倍體(1+)及(-)的病例中診斷宮頸癌2例，CINⅢ及以下病變共716例。篩查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分別為：90.5%、65.5%、66%、78.1%、4.8%、72.5%、99.7%和87.4%，如表8所示。

表8 基于異倍體(2+)篩查宮頸鱗癌的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)

表9為異倍體篩查CIN及宮頸癌診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)匯總結(jié)果，可見(jiàn)異倍體(+)篩查CIN及宮頸癌的靈敏度高達(dá)95%～100%，不易漏診；標(biāo)化陰性預(yù)告值高達(dá)88%～100%；篩查效果優(yōu)于單純異倍體(2+)。單純異倍體(2+)篩查的特異性為66%～88%，標(biāo)化準(zhǔn)確性為78%～85%，優(yōu)于異倍體(+)，但靈敏度較異倍體(+)低，漏診約10%～18%。

表9 異倍體篩查CIN及宮頸癌的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果比較

3 討論

正常人體體細(xì)胞DNA含量是穩(wěn)定的2倍體，并存在少量的整倍體。發(fā)生腫瘤時(shí)，瘤細(xì)胞核內(nèi)染色體異常和DNA含量改變，形成異倍體和非整倍體，并先于細(xì)胞形態(tài)改變。因此，DNA異倍體與腫瘤細(xì)胞增殖有密切關(guān)系，成為腫瘤病理學(xué)研究中的重要分析內(nèi)容。

DNA倍體定量分析系統(tǒng)(AcCell)在20世紀(jì)50年代由加拿大不列顛哥倫比亞省腫瘤研究所研發(fā)并逐步應(yīng)用于宮頸癌篩查，具有測(cè)試結(jié)果快速、客觀、準(zhǔn)確且重復(fù)性好等特點(diǎn)[9]。由于DNA倍體定量分析受標(biāo)本取材、制片、細(xì)胞數(shù)差異、細(xì)胞重疊及測(cè)試儀器參數(shù)設(shè)置不同等因素的影響[10-12]，其檢測(cè)意義還存在不同的認(rèn)識(shí)。2001年孫小蓉等引進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行的大量宮頸癌篩查研究表明，細(xì)胞DNA定量分析方法在宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)方面有重要價(jià)值[4]。

本研究結(jié)果表明：①以異倍體(+)為標(biāo)準(zhǔn)，包括(1+)和(2+)，對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌、以及單純宮頸癌篩查的靈敏度高分別為95.4%、99.2%和100%，標(biāo)準(zhǔn)化準(zhǔn)確度分別為63.9%、64%和61.5%，標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性預(yù)告值分別為58.5%、58.2%和56.5%，標(biāo)準(zhǔn)化陰性預(yù)告值分別為87.5%、97.3%和100%，篩查的靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化陰性預(yù)告值高，其中篩查宮頸癌的靈敏度可達(dá)100%，雖然沒(méi)有漏診發(fā)生，但特異度和標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性預(yù)告值較低。②以異倍體(2+)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌、以及單純宮頸癌篩查的靈敏度分別為77.2%、90.1%和90.5%，特異度分別為87.5%、80.5%和65.5%，標(biāo)化準(zhǔn)確度分別為82.4%、85.3%和78.1%，標(biāo)化陽(yáng)性預(yù)告值分別為86.1%、82.2%和72.5%，標(biāo)化陰性預(yù)告值分別為79.3%、89.0%和87.4%，篩查的靈敏度和標(biāo)化陰性預(yù)告制較異倍體(+)這一篩查標(biāo)準(zhǔn)有所降低，但特異度、標(biāo)化準(zhǔn)確度和標(biāo)化陰性預(yù)告值明顯提高，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于單純以異倍體(1+)為標(biāo)準(zhǔn)的篩查結(jié)果。③在異倍體(+)和異倍體(2+)篩查標(biāo)準(zhǔn)中，篩查的靈敏度與病變程度呈正相關(guān)，上皮內(nèi)瘤變癌變級(jí)別越高，篩查的靈敏度越高，漏診率越低，即DNA倍體分析能有效篩查宮頸癌和宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。

由于通常診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)中的準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)告值和陰性預(yù)告值評(píng)價(jià)指標(biāo)受不同組別樣本構(gòu)成不同因素的影響，表觀評(píng)價(jià)值有可能而產(chǎn)生假象。采用標(biāo)準(zhǔn)化準(zhǔn)確度、標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性預(yù)告值和標(biāo)準(zhǔn)化陰性預(yù)告值評(píng)價(jià)指標(biāo)可避免表觀數(shù)據(jù)因不同組別樣本構(gòu)成不同而產(chǎn)生的假象，從而科學(xué)衡量和評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)的準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)告值和陰性預(yù)告值[5-8]。為此，本研究在診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)中，對(duì)準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)告值和陰性預(yù)告值3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行了標(biāo)化，補(bǔ)充了標(biāo)化準(zhǔn)確度、標(biāo)化陽(yáng)性預(yù)告值和標(biāo)化陰性預(yù)告值3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，使得這3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的結(jié)果不受樣本構(gòu)成不同的影響。

有關(guān)研究指出[13-14]，放療和激素水平紊亂可影響機(jī)體細(xì)胞，出現(xiàn)異倍體，降低DNA倍體定量分析的特異性。因此，在用DNA倍體定量分析進(jìn)行宮頸癌篩查時(shí)，應(yīng)注意放療和激素水平紊亂的影響，通過(guò)進(jìn)一步活檢，排除假陽(yáng)性篩查結(jié)果。

綜上，當(dāng)異倍體(+)，篩查CIN、CINII+III及宮頸癌的靈敏度高，分別為95.4%、99.2%和100%，標(biāo)準(zhǔn)化陰性預(yù)告值分別高達(dá)87.5%、97.3%和100%，但特異度低，標(biāo)準(zhǔn)化準(zhǔn)確度為61%～64%，標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性預(yù)告值為56.5%～58.5%。因此，DNA倍體分析能有效篩查宮頸癌和宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，不易漏整，但確診能力低，對(duì)于篩查陽(yáng)性病例須進(jìn)一步活檢確診。以確診而不是篩查為目的的宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的細(xì)胞學(xué)檢查，則不宜采用宮頸細(xì)胞學(xué)DNA倍體分析檢查，以單純異倍體(2+)為閾值，篩查CINⅡ、Ⅲ及癌可明顯提高篩查的特異度和準(zhǔn)確性度，但靈敏度降低，易出現(xiàn)漏診。以異倍體(+)篩查CINⅡ、Ⅲ及癌的靈敏度高，特異度和準(zhǔn)確度較高。

本研究得到肇慶市科技創(chuàng)新指導(dǎo)類項(xiàng)目(201904031417)和廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201300000192)資助，特此致謝！