張弛 王宇婷 顧詠梅 賈豐璘 周博如

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150000)

病程相關蛋白(PRP或PRs)是植物應對外界非生物與生物脅迫環(huán)境，誘導產生的一類蛋白[1-2]。其中，植物對非生物脅迫的適應主要受ABA-依賴、ABA-非依賴2種信號轉導途徑調控。水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)在抵御生物脅迫中發(fā)揮重要功能，這些激素間往往形成1個具有協同、拮抗作用的交叉通路網絡，最終誘導并激活一系列防御相關基因的表達[3]。PR蛋白主要分為17個家族,廣泛存在于開花植物中, 是植物防衛(wèi)系統的重要組成部分[4]。在病原體侵染、非生物脅迫及相關信號分子、過敏性壞死反應、系統獲得性抗性進程中，PR蛋白會不斷產生、積累，繼而在植物抵御生物及非生物脅迫時發(fā)揮重要作用[4-5]。第一個PR10基因是1988年從歐芹中分離鑒定的，其重要特征是具有1個P環(huán)的富含甘氨酸保守結構域(GxGGxGxxK)，該結構域影響PR10蛋白的核酸酶活性。PR10蛋白另一特征是可形成1個Y型疏水腔，疏水腔參與脂肪酸、細胞分裂素、多類黃酮類化合物等非極性配體的胞內運輸[5]。PR10蛋白疏水腔通過形態(tài)、結構變化與不同配體結合，在植物防御、生長發(fā)育進程中發(fā)揮作用[6-7]。葡萄PR10蛋白具有核酸酶活性[8]。PR10基因可通過染色體簇的形式進行多拷貝復制，從而調節(jié)植物的生長發(fā)育及適應不利環(huán)境[9]。RSOsPR10是一種新的水稻PR10蛋白，在鹽和稻瘟病感染時，可通過茉莉酸信號通路被激活，迅速在根中表達[10]。楊樹具有生長速度快、適應性強、分布范圍廣、材質優(yōu)良等特點，是我國重要的綠化、造林、用材樹種。在我國，土壤鹽堿化及楊樹相關病害嚴重影響了楊樹的生存、生長發(fā)育，成為限制楊樹生產和經濟應用的因素[11]。通過研究楊樹在高鹽、生物脅迫及相關信號分子環(huán)境的表達特點，可為改良楊樹抗逆能力、擴大楊樹栽培范圍，提高我國林業(yè)的生產潛力提供思路。

本研究為探明小黑楊PR10基因應答高鹽、生物脅迫及相關信號分子環(huán)境下的表達特點，從小黑楊(Populussimonii×P.nigra)中克隆PR10基因cDNA片段，對PR10基因進行生物信息學分析，用RT-qPCR分析PR10基因在鹽(NaCl)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸、楊樹葉枯病病原菌脅迫條件時的表達特性，為探明PR10基因在楊樹抗逆中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 目的基因的克隆和表達分析

將來自同一無性系的雙單倍體小黑楊組培苗進行擴繁，將生長1個月的組培苗洗掉培養(yǎng)基，在相對濕度為 60%～70%、14 h光/10 h暗、平均溫度25 ℃條件下繼續(xù)水培1個月。將材料分為5組，每組分為0、12、24、48 h 4個時間點，每個時間點3個生物學重復。分別用水(對照組)、150 mmol·L-1NaCl、2.5 mmol·L-1水楊酸、150 mmol·L-1茉莉酸甲酯脅迫，并使用葉枯病菌餅進行接種[12-13]脅迫。處理0、12、24、48 h后，采集小黑楊的根、葉放入液氮速凍，于冰箱-80 ℃保存。

根據楊樹基因組數據庫信息、基因保守結構域設計引物(表1)，以Actin(基因登錄號:JM986590)為內參引物進行試驗。對目的基因進行PCR擴增、克隆，挑選陽性克隆送至上海生工生物工程公司測序。使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取小黑楊總RNA，通過Primer Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將其反轉錄成cDNA，每個處理包含3個生物重復。用無菌水將cDNA質量濃度稀釋至(100±1)ng·μL-1，作為實時熒光定量PCR的模板。采用SYBR?Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒并參照說明書配置反應體系(表2)進行試驗。用美國 Thernofisher ABI-7500熒光PCR儀進行RT-PCR反應，反應程序為：階段一——95 ℃、30 s；階段二——95 ℃、 5 s，60 ℃、34 s，循環(huán)40次；階段三—— 95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。通過2- ΔΔCT公式計算目的基因在不同樣品的相對表達量，采用SPSS 20軟件進行數據處理，并采用鄧肯氏新復極差法分析差異顯著性。

表2 PR-PCR反應體系

1.2 生物信息學分析

分別用ExPasy(http://web.expasy.org/protparam)在線Protparam軟件、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)的Kyte and Doolittle算法、Singa-P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)的神經網絡算法、TMPred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html#opennewwindow)對PR10蛋白氨基酸的理化性質、PR10蛋白的親水性、PR10蛋白的信號肽和跨膜結構進行預測分析。用SOMPA、swissmodel(http://swissmodel.expasy.org)預測PR10蛋白的二級結構、三級結構。利用NCBI數據庫Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對PR10蛋白的氨基酸序列進行同源序列比對。使用MEGA-X(Version 10.0.5)軟件選擇Neighbor-joining模式并將設bootstrap replications設定為500次構建進化樹，用在線預測軟件Yloc(https://abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi)進行亞細胞定位預測分析[11]。

1.3 PBI121-GFP-PR10植物表達載體構建

根據載體PBI121-GFP與目的基因PR10基因序列，設計含Spe1單酶切位點的酶切引物(表1)，并進行PCR擴增和克隆。將PR10基因片段定向插入PBI21-GFP載體，構建GFP-PR10融合蛋白表達載體，選陽性克隆菌液送至上海生工生物工程公司測序。

表1 試驗引物設計

1.4 基因槍瞬時轉化

利用基因槍法對洋蔥表皮細胞進行瞬時轉化。將V(鎢粉)∶V(0.1 mol·L-1亞精胺)∶V(2.5 mol·L-1氯化鈣 )∶V(1 μg·uL-1質粒)=50∶20∶50∶5 混合，通過渦旋振蕩、離心、懸浮等步驟，最后使用無水乙醇與微?；靹?，制備成微載體。參考PDS-1000臺式基因槍使用說明，在氣壓值達 1 300 psi 時進行基因槍瞬時轉化。瞬時轉化后的洋蔥表皮暗培養(yǎng)24 h后，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

2 結果與分析

2.1 PR10基因克隆及氨基酸理化性質

從小黑楊cDNA中克隆獲得的PR10基因片段，長度為477 bp，編碼158個氨基酸，含20種氨基酸，具完整的開放閱讀框。PR10蛋白的分子量為17.6 KDa，等電點為5.20，不穩(wěn)定系數為34.32，屬于穩(wěn)定蛋白。PR10蛋白總平均疏水指數為-0.186，親水性區(qū)域分布均勻，氨基酸數量較多，為親水蛋白(圖1)。在線軟件SOPMA對楊樹PR10蛋白氨基酸序列二級結構預測顯示(圖2)，該蛋白含有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈無規(guī)則卷曲(表3)。在線軟件swissmodel預測得到圖3所示楊樹PR10蛋白三維結構。

圖3 PR10蛋白三級結構預測圖

表3 PR10蛋白的二級結構

圖1 PR10蛋白氨基酸親疏水性區(qū)域分布圖

序列位置

2.2 信號肽及跨膜結構域預測

信號肽是N端引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的一段氨基酸序列，通常由20～30個氨基酸殘基組成。信號肽預測結果表明，PR10蛋白不存在信號肽(圖4)?？缒そY構是一段一般由20個左右的疏水性氨基酸組成的片段，主要形成α-螺旋。根據在線工具TMPred預測PR10蛋白的跨膜結構，該基因蛋白不存在跨膜結構(圖5)。

圖4 小黑楊PR10蛋白信號肽預測

圖5 小黑楊PR10蛋白跨膜結構預測和分析

2.3 同源性分析

將小黑楊PR10基因與其他同源蛋白基因序列進行比對，構建系統進化樹(圖6)。結果顯示，小黑楊PR10與來自毛果楊(Populustrichocarpa)、毛白楊(Populustomentosa)的PRs蛋白親緣關系較近，聚成一類。而與木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)、葡萄(Vitisvinifera)、歐洲水青岡(Fagussylvatica)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber)的PRs蛋白親緣關系較遠。

圖6 系統進化樹

2.4 亞細胞定位分析

構建GFP-PR10融合表達載體，用基因槍轉化洋蔥表皮細胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察其亞細胞定位(圖7)。結果表明，對照GFP載體在整個洋蔥表皮細胞中均有表達，而GFP-PR10融合蛋白表達載體只能在細胞核中看到綠色熒光。說明PR10定位于細胞核中，這與在線預測軟件Yloc預測分析結果一致。

A、D為暗場觀察；B、E為明場觀察；C、F為二者結合效果。

2.5 PR10基因差異表達分析

在正常條件時，PR10基因在楊樹葉片、根系中均有表達，在根系中的表達水平明顯高于在葉片中的表達水平(表4)。PR10基因受脅迫誘導表達，葉枯病病原菌、NaCl、水楊酸、茉莉酸甲酯均能引起PR10基因上調表達。在葉枯病病原菌脅迫時，PR10基因在葉中的表達水平明顯升高，在48 h的表達水平約為非脅迫對照表達水平的8.86倍。PR10基因在根中表達水平隨脅迫時間延長，表達水平有下降的趨勢，但和對照相比未達到顯著差異水平。受到鹽脅迫時，PR10基因在葉片、根中的表達水平顯著提高，呈現出先升高后降低的趨勢。鹽脅迫下PR10基因在根中12 h時表達水平達到最大，約為非脅迫對照表達水平的15.25倍；在葉中表達水平于12 h時達到峰值，約為非脅迫對照表達水平的2.64倍。水楊酸、茉莉酸甲酯脅迫時，PR10基因在根、葉中的表達水平及變化趨勢與其在鹽脅迫時的表達趨勢相似，水楊酸脅迫使根中PR10基因在24 h時達到最大值，表達水平提高3.75倍；茉莉酸甲酯脅迫使根中PR10基因在12 h時達到最大值，相對表達量提高8.29倍。上述結果說明，PR10基因表達具有組織特異性，并受脅迫誘導表達。

表4 PR10基因相對表達量

3 討論

病程相關蛋白是植物在受到外源病原體入侵時，體內會通過一系列應激反應誘導表達的一類蛋白[14]。PR蛋白在植物的生長發(fā)育和應對生物、非生物脅迫時起到非常重要的作用。PR蛋白分為17個家族，PR10蛋白是其中具有核酸酶或者合成酶活性的1個家族。PR10蛋白能在病毒、細菌、真菌等生物脅迫條件和非生物脅迫時被誘導表達。當脅迫信號被植物細胞表面受體感知，受體會被激活進而引發(fā)信號初級跨膜轉導，胞內產生Ca2+、ROS、cAMP等第二信使，并將信號級聯放大，通過JA/SA、ABA-依賴、ABA-非依賴的信號通路激活WRKY、bZ1P、DREB、MYB等諸多轉錄因子，特異性識別啟動子上的ACCTGACC序列、WRKY、W-box、DRE元件等保守結構域并相結合起到調控PR10基因表達的效果[15]。

PR10基因能在生物脅迫下誘導并參與防御反應。據報道，PR10蛋白在甘蔗黑穗病(Sporisoriumscitamineum)脅迫時能提高葉片細胞中H2O2的積累水平，并增強其對青枯病菌、綠膿桿菌侵染的抗性[16]。在被真菌炭疽病菌侵染時，PR10蛋白積累在白羽扇豆(Lupinusalbus)植株的葉片中[17]。在水稻中，稻瘟病菌感染葉片的試驗表明，RPR10a在對病菌的反應中以局部方式表達最強烈[18]。本研究中，楊樹在接種楊葉枯病后，葉片中PR10基因表達量在48 h內迅速增加并積累，參與植物的防御反應。

PR10基因表達除受病原微生物誘導之外，還受非生物脅迫，如傷害、寒冷、干旱、高鹽、氧化、金屬離子、紫外輻射等的誘導。白羽扇豆PR10蛋白在根系發(fā)育的所有階段均有組成性表達，在其他植物部位也有較小程度的表達，且存在RNAse活性[19]。此外，羽扇豆中PR10基因會受紫外輻射誘導[17]。在西部白松受傷害誘導后，PR10在基因及蛋白水平上均快速升高[20-21]。寒冬里，蘭伯氏松及西部白樺的根中PR10蛋白水平積累到最高水平[22]。同樣，冷脅迫誘導PR10的表達也發(fā)生在桃樹中，冬季大量積累在樹皮、木質部中的蛋白質，被認為是儲存氮的載體，有助于樹木抵御或恢復非生物及生物脅迫[23]。本研究顯示，鹽脅迫能誘導根部的PR10基因迅速且大量地表達，說明楊樹PR10基因參與到了鹽脅迫的抗逆進程中。楊樹PR10基因還能被茉莉酸甲酯、水楊酸誘導，但其對水楊酸的反應相較于茉莉酸甲酯，表現更慢，2種激素誘導的PR10基因表達量均隨著時間增加而降低，這一點與在JcPR10及RSOsPR10中的研究一致[13，24]。不過，在JcPR10a研究中水楊酸與茉莉酸互為抑制反應，這一點在本研究中未能展現[13]。

本研究中，從小黑楊中克隆出477 bp的PR10基因，對該基因進行了生物信息學分析、不同植物同源蛋白進化樹構建、亞細胞定位、時空表達分析。PR10基因在應答高鹽、茉莉酸甲酯、水楊酸、楊樹葉枯病脅迫時具有明顯的組織特異性，且具有較高的表達。說明楊樹PR10基因參與植物滲透脅迫，與增強植物抗逆性有關，可以作為楊樹抗逆分子育種的備選方向。