劉剛 王效武 楊紀忠 鄭曉汾 韓玉萍 趙炬?zhèn)?侯廣平 于花

作者單位：山西省眼科醫(yī)院，太原 030002

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病在眼部最嚴重的并發(fā)癥，可導致不可逆的視力損害，是工作人群（20～65歲）致盲的主要原因[1]。全視網(wǎng)膜光凝（Panretinal photocoagulation，PRP）是目前公認的可以有效阻止DR進展的治療方法；但是，作為一種破壞性的治療手段，PRP在發(fā)揮作用的同時也會對眼內(nèi)組織的正常結(jié)構(gòu)和功能造成一定的影響[2]。有研究認為，PRP是2型糖尿病患者眼表異常的高危因素[3]，可以導致角膜知覺減退和淚膜穩(wěn)定性下降，并且可以加重患者的角膜神經(jīng)損傷[4]。目前，PRP導致角膜神經(jīng)損傷的確切機制還沒有闡明；多數(shù)學者認為可能與睫狀后長神經(jīng)的熱損傷有關(guān)[5]。近年來，免疫機制在角膜神經(jīng)損傷中的作用日益受到重視。有研究指出，糖尿病患者角膜上皮基底神經(jīng)密度下降與朗格漢斯細胞（Langerhans cell，LC）密度增加有關(guān)[6]；并且糖尿病動物模型研究也表明，LC和角膜上皮基底神經(jīng)的直接接觸可能是糖尿病角膜神經(jīng)損傷的觸發(fā)因素[7]。因此，本研究利用角膜共焦顯微鏡（Corneal confocal microscopy，CCM）觀察了PRP治療前后LC的變化，并分析其與角膜上皮基底神經(jīng)（Subbasal nerve plexus，SNP）變化之間的關(guān)系，初步探討免疫機制在PRP導致的角膜神經(jīng)損傷中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象

納入標準：①年齡50～65歲；②經(jīng)內(nèi)分泌科確診為2型糖尿病，且病程10～15年；③糖化血紅蛋白6.5%～7.0%；④標準對數(shù)視力表單眼視力＞0.1；⑤眼壓正常；⑥眼表無明顯炎癥表現(xiàn)，角膜光滑、透明；⑦同意接受檢查并能按時完成隨訪者。排除標準：①瞳孔過小或玻璃體積血無法完成PRP者；②合并黃斑水腫或新生血管性青光眼；③合并其他眼底血管性疾病或先天異常；④眼外傷、眼部手術(shù)及激光治療史；⑤干眼、角膜斑翳、翼狀胬肉、圓錐角膜、高度近視、過敏性結(jié)膜炎、感染性角結(jié)膜炎、葡萄膜炎、青光眼病史或眼部持續(xù)用藥史；⑥角膜接觸鏡配戴史；⑦除糖尿病以外的其他影響神經(jīng)功能的系統(tǒng)性疾病和相關(guān)治療史；⑧Ⅰ型糖尿病或其他特殊類型的糖尿病；⑨糖尿病合并酮癥酸中毒或高滲綜合征；⑩結(jié)締組織病；?慢性肝臟或腎臟疾病；?PRP或隨訪期間接受抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）藥物或內(nèi)眼手術(shù)治療者：?隨訪期間需要補充激光治療者。

選取2019年4 ─11月就診于山西省眼科醫(yī)院激光室，經(jīng)眼底熒光血管造影確診為雙眼糖尿病視網(wǎng)膜病變Ⅳ期的2型糖尿病患者。本研究經(jīng)山西省眼科醫(yī)院倫理委員會審核批準（倫理號：201804b），所有受檢者對本研究目的和方法知情并自愿參加本研究。

1.2 方法

所有患者均選擇病情較重眼為治療眼，對側(cè)眼為對照眼。分別于PRP治療前、第1次光凝后1周、第2次光凝后1周、第3次光凝后1周、第4次光凝后1周和PRP完成后1個月行裂隙燈顯微鏡、眼壓、眼底和CCM檢查。按照先非接觸性、后接觸性檢查的順序進行。

1.2.1 一般眼科檢查 入選患者常規(guī)行裂隙燈顯微鏡、非接觸性眼壓和眼底檢查，排除眼表存在明顯炎癥，角膜存在瘢翳、新生血管、增生物和上皮缺損，虹膜紅變以及前房炎癥反應(yīng)等；明確眼壓是否正常，眼底是否符合DR Ⅳ期表現(xiàn)、激光后是否有玻璃體積血等并發(fā)癥出現(xiàn)。

1.2.2 CCM檢查與圖像分析 采用海德堡Ⅱ代激光斷層掃描系統(tǒng)（HRT-Ⅱ）（德國海德堡工程有限公司）的Rostock角膜模塊完成。角膜接觸帽與鏡頭之間的耦合劑使用卡波姆滴眼液（美國博士倫公司）。受檢者采用0.2%丙美卡因滴眼液（美國愛爾康公司比利時分公司）表面麻醉。掃描深度定位到SNP層后，首先查找渦狀結(jié)構(gòu)，然后以這一結(jié)構(gòu)為中心以“回”字型方式向外移動顯微鏡物鏡擴展檢查范圍，使用“Section”模式快速采集渦狀區(qū)及其周圍2～3 mm范圍的SNP圖像。所得圖像在Photoshop CC 2017圖像處理軟件（美國奧多比系統(tǒng)公司）中載入堆棧，將單張圖像拼接合成局部形態(tài)圖；再以渦狀結(jié)構(gòu)為中心裁剪700 μm×700 μm大小的圖片，使用Image J圖像分析系統(tǒng)（美國國家心理健康研究所）進行定量分析。使用Neuron J插件計算單位面積的神經(jīng)纖維長度（Nerve fiber length，NFL）（mm/mm2）；使用Cell Counter功能分析成熟LC和未成熟LC密度。

1.2.3 PRP治療 復方托吡卡胺滴眼液[參天制藥（中國）有限公司]充分散瞳，0.2%丙美卡因滴眼液表面麻醉2次，由同一位經(jīng)驗豐富的激光治療醫(yī)師使用SupraScan 577多點掃描激光器（法國光太醫(yī)療公司）分4次完成標準PRP，每次間隔1周。光凝采用方形矩陣模式，周邊視網(wǎng)膜因弧度變化導致聚焦困難或臨近大血管處給予單點模式補充治療。每期光斑數(shù)為600～800個，療程結(jié)束時，光斑總數(shù)達到2 500～3 000個。激光參數(shù)設(shè)定為：光斑直徑100～300 μm；功率100～200 mW；曝光時間0.05 s；光斑間隔1/2光斑直徑；光凝強度達到Tso分級Ⅲ級輕～中度光斑反應(yīng)。每次激光結(jié)束后均給予局部普拉洛芬滴眼液（山東海山藥業(yè)有限公司）點眼4次/d，共1個月。

1.3 統(tǒng)計學方法

前瞻性臨床研究。采用SPSS l8.0和SAS統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示；計數(shù)資料用頻數(shù)表示。觀察組與對照組不同觀察時間點LC密度和NFL值比較采用重復測量方差分析，多重比較采用Bonferroni檢驗。重復測量的NFL值和LC密度的相關(guān)性分析采用SAS軟件的MIXED模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

共納入符合條件的患者49例，其中男20例，女29例，年齡（55.1±4.3）歲。所有患者觀察期內(nèi)均無眼壓升高、眼內(nèi)炎癥、活動性出血和補充激光。

2.1 PRP治療后SNP改變

DR患者對照眼渦狀區(qū)基線NFL值為（15.1±3.0）mm/mm2，治療眼為（15.5±3.7）mm/mm2，二者比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.536，P=0.593）。接受PRP治療后部分患者出現(xiàn)SNP神經(jīng)纖維變細，伴有不同程度的渦狀區(qū)神經(jīng)結(jié)構(gòu)缺失的神經(jīng)損傷表現(xiàn)。治療眼各觀察時間點NFL值總體比較差異有統(tǒng)計學意義（F=8.039，P=0.004），其中，PRP治療前與第2次光凝后1周、第3次光凝后1周和第4次光凝后1周NFL值比較差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.018、0.012、0.007）；對照眼各觀察時間點NFL值總體比較差異無統(tǒng)計學意義（F=0.136，P=0.929）。見表1。

2.2 PRP治療后LC改變

DR患者對照眼基線LC密度為（46±53）cells/mm2，治療眼為（40±54）cells/mm2，二者比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.511，P=0.611）。PRP治療后有25例患者出現(xiàn)LC密度增加，主要表現(xiàn)為以渦狀區(qū)為中心的聚集。其中6例患者在第1次激光后就出現(xiàn)LC密度增加；7例患者在第2次激光后出現(xiàn)LC密度增加；5例患者在第3次激光后出現(xiàn)LC密度增加；另外7例患者在第4次激光后出現(xiàn)LC密度增加。治療眼各觀察時間點LC密度總體比較差異有統(tǒng)計學意義（F=12.350，P＜0.001），其中，PRP治療前與第3次光凝后1周、第4次光凝后1周以及PRP完成后1個月LC密度比較差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.004、0.002、0.001）；而對照眼各觀察時間點LC密度總體比較差異無統(tǒng)計學意義（F=1.624，P=0.169）。見表2。

PRP治療開始后，治療眼LC密度逐漸增加，且在第3次、第4次激光后漲幅最為明顯，在PRP完成后1個月又開始出現(xiàn)回落。由此可見，LC密度與光凝次數(shù)存在明顯的相關(guān)性，隨著光凝次數(shù)的增加，LC密度逐漸增加。Pearson相關(guān)分析顯示第4次激光后1周（即PRP完成后）LC密度與其基線水平呈正相關(guān)（r=0.674，P＜0.001）。

2.3 SNP改變與LC改變之間的相關(guān)性

在LC密度增加的患者中有3例出現(xiàn)大量LC活化，其浸潤區(qū)SNP神經(jīng)結(jié)構(gòu)嚴重破壞（見圖1）。相關(guān)分析也顯示，重復測量的NFL值與LC密度呈負相關(guān)（-P=-0.041）。

3 討論

正常角膜組織內(nèi)不含血管和淋巴管，理論上具有免疫赦免特性。但是，角膜移植術(shù)后仍然有一部分患者會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，其中一個重要的原因就是角膜上皮抗原提呈細胞——LC的存在[8]。LC屬于髓源性樹突狀細胞，是眼表免疫系統(tǒng)中的專職抗原提呈細胞。生理狀態(tài)下，LC主要分布于角膜上皮和上皮基底層[9]，其密度由角鞏膜緣向角膜中央逐漸遞減[10]。不僅密度降低，其不同部位的細胞狀態(tài)也有差別。角膜中央的LC主要為未成熟細胞，而在角膜緣和周邊角膜則存在少量的成熟細胞[11]。未成熟LC胞體較大，呈橢圓形或長形，抗原吞噬能力強但無抗原提呈功能，主要誘導免疫耐受；成熟的LC胞體變小，伸出細長的樹突狀結(jié)構(gòu)，抗原吞噬能力減弱，但免疫誘導能力大大增強[12，13]。近年來隨著對LC認識的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)其在眼表疾病的發(fā)病機制中呈現(xiàn)雙面性，即既能吞噬抗原導致免疫耐受，又可呈遞抗原導致免疫反應(yīng)，激活效應(yīng)T細胞進一步放大炎性反應(yīng)規(guī)模[14]。

正常情況下角膜內(nèi)LC處于靜止狀態(tài)，當受到外界刺激（如微生物感染、異物、外傷、化學物質(zhì)等）時，角膜細胞可釋放白細胞介素-1和集落刺激因子等細胞因子，誘導LC聚集并活化[15，16]。Alzahrani等[17]研究指出，配戴角膜接觸鏡2 h角膜中央LC即可增加2倍，表明角膜接觸鏡可以誘發(fā)急性亞臨床炎癥反應(yīng)。既往研究表明，通過CCM拍攝的LC已被基礎(chǔ)和臨床用于評估在體角膜的炎癥水平，并得到廣泛認可[18-20]；但是受觀察視野小和定位功能差的限制，CCM在縱向研究中的應(yīng)用備受質(zhì)疑。本研究借鑒國外先進的拼圖技術(shù)，有效克服了CCM檢查設(shè)備的局限性。我們借助拼圖觀察了PRP治療前后DR患者LC的變化，結(jié)果顯示：在PRP治療過程中，LC密度明顯增加，并且出現(xiàn)以渦狀區(qū)為中心的聚集，部分細胞甚至被激活而轉(zhuǎn)化為成熟狀態(tài)。并且隨著光凝次數(shù)的增加，LC密度逐漸增加，在PRP治療結(jié)束后又開始趨于穩(wěn)定并緩慢下降，表明LC密度與光凝次數(shù)存在明顯的相關(guān)性。推測其原因可能是PRP治療作為一種刺激因素，其反復多次的激光輻射、接觸鏡所致的缺氧狀態(tài)以及接觸鏡與角膜之間的摩擦都可能造成角膜上皮細胞的微損傷，導致炎癥標志物表達增加，從而刺激LC向渦狀區(qū)聚集和活化[17，21，22]。

表1.糖尿病視網(wǎng)膜病變患者接受全視網(wǎng)膜光凝治療后治療眼和對照眼各觀察時間點神經(jīng)纖維長度值（mm/mm2）比較Table 1.Comparison of the NFL value (mm/mm2) among each observation time point in the treatment eye and control eye after PRP treatment in DR patients

表2.糖尿病視網(wǎng)膜病變患者接受全視網(wǎng)膜光凝治療后治療眼和對照眼各觀察時間點朗格漢斯細胞密度（cells/mm2）比較Table 2.Intra group comparison of the LC density (cells/mm2) among each observation time point in the treatment eye and the control eye after PRP treatment in DR patients

很多組織中都可以觀察到樹突狀細胞與感覺神經(jīng)纖維緊密接觸[23-25]；在神經(jīng)-肥大細胞共培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突與肥大細胞之間存在著形態(tài)學聯(lián)系，其接觸點還存在囊泡[26]，表明二者之間可能存在一定的相互作用。最近的一項研究表明，皮膚組織中約75%的樹突狀細胞緊密靠近或者直接與感覺神經(jīng)接觸，并且通過這種物理接觸而相互作用。在角膜上皮基底層內(nèi)，LC通常也位于SNP神經(jīng)纖維周圍[27]。Tavakoli等[6]通過CCM觀察到糖尿病患者LC密度增加和神經(jīng)纖維數(shù)量減少之間存在負相關(guān)關(guān)系。因此他們認為，免疫機制可能介導了糖尿病患者早期的角膜神經(jīng)損傷。此后，Leppin等[7]通過對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型觀察發(fā)現(xiàn)，高血糖導致角膜LC浸潤，LC和SNP神經(jīng)纖維的直接接觸可能是糖尿病角膜神經(jīng)損傷的觸發(fā)因素。此外，Mandathara等[28]關(guān)于圓錐角膜的研究也認為，SNP神經(jīng)纖維密度下降與LC增加有關(guān)。本研究也觀察到PRP治療后出現(xiàn)LC密度增加和SNP神經(jīng)纖維長度下降，并且在成熟LC浸潤區(qū)還出現(xiàn)SNP神經(jīng)結(jié)構(gòu)的缺失；進一步統(tǒng)計學分析顯示重復測量的NFL值與LC密度呈負相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果與上述國外針對糖尿病和圓錐角膜患者的研究中角膜神經(jīng)損傷與LC增加有關(guān)的結(jié)果一致，因此我們推測免疫機制也參與介導了PRP治療后糖尿病患者的角膜神經(jīng)損傷。但是，在De Cillà等[4]的研究中，PRP治療后DR患者的角膜神經(jīng)損傷增加了33%，而本研究中PRP治療后1個月NFL值僅較治療前輕度下降，表明PRP導致的角膜神經(jīng)損傷還有其他因素的參與。

綜上所述，本研究借助拼圖技術(shù)觀察了PRP治療前后LC的變化，并分析了其與SNP變化之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)PRP多次光凝可以導致LC密度增加，并且成熟LC還可以導致SNP神經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞，從而提出了免疫機制可能介導PRP治療后SNP損傷的推斷，從而豐富了PRP治療后角膜神經(jīng)損傷機制理論。當然，本研究僅僅是利用CCM從形態(tài)學方面分析了LC在PRP治療后SNP損傷中的作用，并未進行相關(guān)組織學和免疫學指標的檢測，其具體機制有待進一步體外研究的論證。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明劉剛：收集數(shù)據(jù)；撰寫論文；對編輯部的修改意見進行修改。王效武、楊紀忠、鄭曉汾、韓玉萍：參與選題、設(shè)計，資料的分析和解釋。趙炬?zhèn)?、侯廣平：收集數(shù)據(jù)。于花：收集數(shù)據(jù)；參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果和結(jié)論，對編輯部的修改意見進行修改