公慧敏 周占宇 劉桂香

作者單位：1青島市市立醫(yī)院眼科中心 266011；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科 266003

斜視是一種眼外肌運(yùn)動平衡功能失調(diào)性疾病，分為共同性斜視和非共同性斜視。其中共同性外斜視最為多見，尤其在亞洲地區(qū)患病率為1%[1，2]，嚴(yán)重影響患者視力、雙眼立體視功能[3]。共同性外斜視的病因涉及到遺傳與環(huán)境等多個因素。斜視的遺傳性早在希波克拉底時代就開始被學(xué)者們關(guān)注，近年來許多國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量基因水平的研究，發(fā)現(xiàn)了一些可能的敏感位點(diǎn)，但至今仍然缺乏精確的基因定位[4]。隨著各種測序技術(shù)的進(jìn)步，特別是全外顯子組測序（Whole-exome sequencing，WES）技術(shù)的興起，為共同性外斜視致病基因的研究提供了契機(jī)。WES是一種利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子捕獲并富集，然后進(jìn)行高通量測序的基因組分析方法。它是一種更高效的測序策略，能夠直接發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)功能變異相關(guān)的遺傳變異，大大促進(jìn)了新致病基因的發(fā)現(xiàn)，并且相對于全基因組測序成本更低，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于尋找與各種復(fù)雜疾病相關(guān)的致病基因和易感基因的研究中。

本研究對一個共同性外斜視家系的6位成員外周血DNA進(jìn)行全外顯子組測序，通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，篩選共同性外斜視可能的致病基因，針對篩選出的突變基因設(shè)計引物，使用Sanger測序在散發(fā)患者中驗(yàn)證突變。以期為共同性外斜視致病基因的研究，乃至為預(yù)防及治療疾病提供理論依據(jù)，進(jìn)而為提高孕期胎兒的診斷水平、及早排查出可能攜帶有致病基因的患兒，以及早期對致病基因進(jìn)行干預(yù)，從而為提高人口素質(zhì)、優(yōu)生優(yōu)育的目標(biāo)提供思路。

1 對象與方法

1.1 對象

實(shí)驗(yàn)研究。本研究選取一個3代6人的共同性外斜視家系，家系中先證者為7歲女童，其與其母親均為恒定性外斜視患者，其余家庭成員均無斜視。家系圖見圖1，2例患者臨床資料見表1。另外選取共同性外斜視散發(fā)患者180例，其中男80例，女100例，年齡3歲10個月～64（27.9±1.6）歲。其中間歇性外斜視患者113例，恒定性外斜視患者67例。150例正常對照者，其中男70例，女80例，年齡4～60（29.8±1.8）歲。

圖1.共同性外斜視家系圖譜□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；：先證者（女）Figure 1.The family tree of the comitant exotropia pedigree.□:Normal male; ○:Normal female; ●:Female patient;:Proband(Female).

共同性外斜視診斷由青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科2名副主任以上專業(yè)醫(yī)師共同作出。研究中所有對象（不滿18歲的成員，由其法定監(jiān)護(hù)人）簽署知情同意書。本研究的所有對象均來自中國山東省青島市，均為中國漢族人群。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號：QYFY WZLL 25717）。本研究遵循赫爾辛基宣言。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 抽取家系成員外周血5～6 ml，使用中國天根生化科技有限公司DNA提取盒獲得樣本DNA。

1.2.2 全外顯子組測序 取2 μg基因組DNA，使用Bioruptor將其機(jī)械打斷，使片段主帶在200 bp附近，回收150～250 bp的DNA片段，對其進(jìn)行末端修復(fù)及磷酸化，3'端加A尾后連接測序接頭，純化連接產(chǎn)物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物純化得到DNA預(yù)文庫。取一定量預(yù)文庫與Sureselect Human All Exon v5外顯子捕獲試劑盒中的探針做雜交，之后使用帶鏈霉素的磁珠捕獲基因上的外顯子。將未雜交上的片段洗脫掉，將雜交產(chǎn)物回收后行PCR擴(kuò)增富集，回收擴(kuò)增產(chǎn)物即為終文庫。對文庫進(jìn)行質(zhì)控，對合格的外顯子序列使用Illumina Hiseq 4000測序儀測序，得到初始數(shù)據(jù)（外顯子測序流程見圖2）。

表1.共同性外斜視家系中2例患者基本資料Table 1.The basic information of the two patients in the concomitant exotropia pedigree

圖2.外顯子測序流程示意圖Figure 2.The flow diagram of exome sequencing.

1.2.3 生物信息分析 用SeqPrep和Sickle對外顯子測序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。用Bwa軟件將質(zhì)控后數(shù)據(jù)比對到參考基因組hg19上，得到Bam格式的原始比對結(jié)果。對結(jié)果使用Samtools排序。Picard標(biāo)記重復(fù)Reads生成最終Bam文件。利用重復(fù)標(biāo)記過的比對結(jié)果進(jìn)行覆蓋度、測序深度和外顯子區(qū)域捕獲率的統(tǒng)計。GATK軟件預(yù)測SNV和Indel。過濾掉單核苷酸變異數(shù)據(jù)庫dbSNP138和千人基因組工程數(shù)據(jù)庫1000 genome中的高頻（MAF＞0.01）位點(diǎn)，保留低頻變異位點(diǎn)。家系分析篩選，保留與疾病共分離的變異位點(diǎn)。使用Oncotator v1.5.3.0，Annovar，SIFT和Polyphen-2等工具對篩選的位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋，保留至少2個以上軟件評估為有害（Damaging）的位點(diǎn)（流程見圖3）。

圖3.生物信息數(shù)據(jù)分析基本流程Figure 3.The flow diagram of the bioinformatics analysis.

1.2.4 Sanger測序 針對外顯子測序篩選到的候選基因PAX3對納入本研究的所有成員進(jìn)行Sanger測序。首先利用Primer 3.0在線軟件設(shè)計PCR引物對：F 5'-TGTGGTCTCTGTCCCAAGATGTA-3'，R 5'-GGAGGAAAATAAAAAGCAAAGAAC-3'。PCR擴(kuò)增，制作測序模版，對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)，酒精法純化測序反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)產(chǎn)物在ABI 3500型基因分析儀上進(jìn)行測序分析。

2 結(jié)果

2.1 外顯子測序及生物信息分析結(jié)果

外顯子組測序的數(shù)據(jù)產(chǎn)出及數(shù)據(jù)統(tǒng)計表見表2。GATK軟件預(yù)測突變，共發(fā)現(xiàn)525 787個單核苷酸突變位點(diǎn)。過濾掉1 000 G及dbSNP138數(shù)據(jù)庫中的高頻變異位點(diǎn)后得到1 340個變異位點(diǎn)，通過家系分析保留與疾病共分離的變異位點(diǎn)得到328個變異位點(diǎn)，多種注釋工具對所得變異進(jìn)行功能注釋，最終得到23個候選基因（注釋結(jié)果見表3）。按照2015年版《美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和指南》[5]對突變位點(diǎn)的有害性進(jìn)行評估，搜索文獻(xiàn)分析變異與共同性外斜視疾病的相關(guān)性，最終認(rèn)為PAX3基因的c.G434T突變（p.R145L）可能是致病突變。這一突變位于PAX3基因高度保守的PD結(jié)構(gòu)域。

2.2 Sanger測序結(jié)果

家系中2例患者均攜帶PAX3基因的c.434G＞T雜合錯義突變，家系正常成員均未檢測到此突變，突變在家系中與疾病共分離。180例散發(fā)患者中檢測到27例患者發(fā)生PAX3c.434G＞T突變。在150例與家系無血緣關(guān)系的正常對照組中，均未發(fā)現(xiàn)此突變。正常人及患者Sanger測序圖見圖4。

3 討論

斜視的家族遺傳性早在希波克拉底時代就已經(jīng)被注意到[6]，近年來國內(nèi)外的許多學(xué)者也致力于共同性外斜視遺傳學(xué)的病因研究。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，約30%的斜視患者有陽性家族史[7]，普通人群中斜視的患病率為3%，而斜視患者子女的患病率高至13%[8]，斜視患者的同卵雙胞胎的患病率高達(dá)73%。各種族的患病率也明顯不同，白種人患病率較高為2.7%，而非洲人為0.6%[9]，以上研究充分證實(shí)了斜視的遺傳基礎(chǔ)。

近年來，為了尋找共同性外斜視的致病基因，國內(nèi)外學(xué)者對共同性外斜視家系進(jìn)行了研究，提出了一些敏感位點(diǎn)。日本學(xué)者以55個共同性外斜視家系為研究對象，使用全基因MOD評分法分析，發(fā)現(xiàn)了染色體4q28.3和7q31.2為敏感位點(diǎn)，并且有來源于父親和母親的遺傳現(xiàn)象[10]。Zhang和Matsuo[11]對日本的共同性外斜視家系進(jìn)行基因?qū)W分析，篩選出MGST2和WNT2為可能的敏感基因。劉桂香等[12]

選擇共同性外斜視家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了ARIX基因突變，ARIX基因位于染色體1lql3上，由3個外顯子組成，編碼1個同源結(jié)構(gòu)域翻譯因子，對于腦干運(yùn)動神經(jīng)元亞群的生存和傳代起到重要作用，并可能參與交感神經(jīng)興奮和眼位控制，因此認(rèn)為它的突變可能導(dǎo)致斜視發(fā)生，但未在廣泛的人群中進(jìn)行驗(yàn)證。但隨后也有學(xué)者又對一個家族性共同性外斜視家系研究，并沒有發(fā)現(xiàn)患者有ARIX基因的突變[13]。

表2.共同性外斜視家系外顯子測序原始數(shù)據(jù)及統(tǒng)計結(jié)果Figure 2.The raw data and statistical results of exome sequencing in concomitant exotropia pedigree

表3.共同性外斜視家系候選基因位點(diǎn)及主要注釋結(jié)果Figure 3.The candidate gene sites and main annotated results in the concomitant exotropia pedigree

圖4.PAX3基因c.434G>T錯義突變Sanger測序圖A：正常人Sanger測序結(jié)果序列；B：先證者G434T突變Sanger測序結(jié)果序列。紅色箭頭所指為正常位點(diǎn)，藍(lán)色箭頭所指為突變位點(diǎn)Figure 4.Sanger sequencing of c.434G>T missense mutation in PAX3 gene.A:Sanger sequencing results of normal people.B:Sanger sequencing results of the proband.The red arrow indicates the normal site and the blue arrow indicates the mutation site.

因此，迄今為止，確定共同性外斜視的致病基因仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。外顯子測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用為尋找共同性外斜視的致病基因提供了契機(jī)。本研究選取了一個3代6人的共同性外斜視家系進(jìn)行病因?qū)W研究，取家系成員外周血進(jìn)行全外顯子組測序后，對讀取的變異進(jìn)行生物學(xué)數(shù)據(jù)分析，過濾掉dbSNP138及1000 genome數(shù)據(jù)庫中的高頻率（MAF＞0.01）變異，保留罕見的低頻變異。去除在家系測序樣本中與疾病不共分離的變異，保留共分離變異位點(diǎn)。對多個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行過濾，保留外顯子區(qū)的非同義突變，參照2015年版《美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和指南》并結(jié)合文獻(xiàn)對變異進(jìn)行判定。最終認(rèn)為PAX3基因的c.434G＞T可能是共同性外斜視致病相關(guān)突變。PAX基因是一個進(jìn)化上較為保守的基因家族，普遍存在于自然界各物種中。PAX3作為PAX基因家族中的一員，是一種在胚胎發(fā)育過程中調(diào)控各組織器官分化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[14，15]。PAX3蛋白通過與下游靶基因的DNA片段結(jié)合并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[16]來行使其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。

人類PAX3基因于細(xì)胞核中表達(dá)，位于2號染色體（2q36.1），共含有8個外顯子，全長99 110 bp，編碼的蛋白質(zhì)含有479個氨基酸，相對分子量為52 968 Da。PAX3蛋白有3個重要的功能結(jié)構(gòu)域，分別為：配對盒結(jié)構(gòu)域（Paired box domain，PD，34～161位氨基酸）、同源異型類結(jié)構(gòu)域（Homeobox domain，HD，220～277位氨基酸）、高度保守的鋅肽序列和富含絲氨酸-蘇氨酸-脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域（Transcription activation domain，TA，278～479位氨基酸）[17-19]，PD是PAX3重要的功能結(jié)構(gòu)域，PAX3即通過PD識別并結(jié)合下游靶基因的DNA序列，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[20]，PD結(jié)構(gòu)域除行使與下游靶基因DNA結(jié)合的功能外，同時還可以促進(jìn)PAX3蛋白與其他蛋白的相互作用，因此PD結(jié)構(gòu)域的功能幾乎可以影響PAX3蛋白的全部功能，發(fā)生在此區(qū)域的變異可能會嚴(yán)重影響蛋白功能。本研究的外顯子測序發(fā)現(xiàn)的PAX3基因c.G434T突變是一雜合錯義突變，其434位上的堿基G變?yōu)閴A基T，這一突變正是位于PAX3保守的PD結(jié)構(gòu)域中。新發(fā)突變保留了PAX3各結(jié)構(gòu)域的完整性，因此推測其突變蛋白R145L與野生型PAX3蛋白具有相同的亞細(xì)胞定位。突變蛋白R145L，其145位帶正電的極性精氨酸變?yōu)榱朔菢O性的亮氨酸，推測氨基酸極性的改變可能會引起蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步影響蛋白的功能?；蚬δ茴A(yù)測軟件Polyphen2等也預(yù)測到此突變很可能影響了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，是有害突變，但具體影響的程度還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

PAX3基因是生肌調(diào)控中重要的上游基因[21]，它在骨骼肌的形成過程中發(fā)揮了不可替代的作用[22，23]。有研究表明，當(dāng)生肌前體細(xì)胞移行到肌芽等目的地并且表達(dá)肌肉分化因子、進(jìn)一步開始分化的時候，PAX3的表達(dá)開始下調(diào)[24]。如果PAX3的表達(dá)水平仍然繼續(xù)維持在原水平，生肌前體細(xì)胞的分化將被阻止，而不能達(dá)到完全分化狀態(tài)[25]。PAX3基因缺失時，骨骼肌的發(fā)生、發(fā)育將被阻止[26-29]。有學(xué)者運(yùn)用cDNA微陣分析導(dǎo)入了PAX3基因的NIH3T3細(xì)胞的基因表達(dá)譜，來進(jìn)一步闡明PAX3在骨骼肌發(fā)生中的作用，研究發(fā)現(xiàn)PAX3基因激活了大量轉(zhuǎn)錄因子如MYOK、MYOG、SIX1、SLUG與IGF2及其受體IGFBP5，而這些因子均是與骨骼肌發(fā)生密切相關(guān)的基因[30-32]。此外，Kozawa等[33]發(fā)現(xiàn)來自轉(zhuǎn)基因小鼠的成肌細(xì)胞表達(dá)PAX3/FOXO1蛋白就不能完成成肌分化。這些發(fā)現(xiàn)均表明PAX3基因與骨骼肌的發(fā)生和功能密切相關(guān)。眼外肌屬于骨骼肌，它的發(fā)生發(fā)育也應(yīng)受到PAX3的調(diào)控，結(jié)合我們的發(fā)現(xiàn)推測PAX3基因的突變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能變化，眼外肌的發(fā)生或者發(fā)育過程因此受阻，這可能是參與斜視發(fā)生的因素之一。

全外顯子組測序篩選出的除PAX3之外的22個候選基因?qū)⑹俏覀兿乱徊缴钊胙芯康膶ο蟆ｋm然我們發(fā)現(xiàn)PAX3基因c.G434T突變可能是共同性外斜視的致病突變之一，但PAX3基因突變的具體致病機(jī)制，突變所導(dǎo)致的蛋白表達(dá)及功能變化、突變對下游因子的影響等仍然需要進(jìn)一步的探索。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明公慧敏：收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。周占宇：參與選題、設(shè)計和修改論文的結(jié)果、結(jié)論。劉桂香：參與選題、設(shè)計、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修