常巍，陳科元，楊世麗，袁夢，陳小麗，唐耀，馬燕梅*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002；2. 福州動物園,福建 福州 350012)

鸚鵡喙羽病(psittacine beak and feather disease，PBFD)的病原為鸚鵡喙羽病病毒(psittacine beak and feather disease virus，PBFDV)，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)[1-2]。PBFD的臨床癥狀主要為羽毛和喙出現(xiàn)病變，患病鸚鵡的羽毛出現(xiàn)對稱性萎縮、脫落或異常生長，新生羽毛發(fā)育不全甚至停留在羽管階段，有些鸚鵡的喙出現(xiàn)畸形甚至變黑，爪出現(xiàn)異常變形[3-4]。PBFD是一種免疫抑制性傳染病，患病鸚鵡雖然不會即刻死亡，但PBFDV會侵襲鸚鵡的法氏囊和胸腺等免疫器官，抑制機體免疫功能，從而出現(xiàn)繼發(fā)感染或者混合感染導(dǎo)致死亡[5]。Todd[6]報道PBFD可通過水平傳播和垂直傳播，且目前尚無商品化的疫苗可供使用。因此，本病對鸚鵡的養(yǎng)殖業(yè)造成極大威脅。PBFDV為單股DNA病毒，其基因組大小約為1.7～2.0 kb，基因組主要包括2個相反方向的開放閱讀框(open reading framework，ORF)，一個編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)，另一個編碼衣殼蛋白(Cap)。Rep參與啟動基因組的滾環(huán)復(fù)制，具有特定的核苷酸結(jié)合基序，具有解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，可識別和結(jié)合基因組DNA[7]。Cap蛋白是病毒粒子的組成部分，具有核定位功能，在引導(dǎo)病毒DNA進入細(xì)胞核，以及病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)的組裝中起重要作用[8]。由于Cap蛋白具有免疫原性，突變率較高，所以常用于PBFD流行病學(xué)以及系統(tǒng)進化等相關(guān)研究中一個可靠的基因遺傳進化標(biāo)記。

迄今為止，全世界約40個國家報道PBFD的存在，包括野生鸚鵡和圈養(yǎng)鸚鵡均有感染此病[9-10]。2002年我國臺灣報道非洲灰鸚鵡(Psittacuserithacus)和吸蜜鸚鵡(Vinikuhlii)感染此病[11]。2009年[12]、2012年和2017年山東[13-14]及2018年北京分別報道有PBFD存在[15]，2019年山東、河北、江蘇和福建也發(fā)現(xiàn)此病[16-17]。為調(diào)查福建部分地區(qū)鸚鵡感染PBFD及PBFDV的遺傳進化情況，本文分別對福州市某動物救助站、福州動物園、三明動物園、福州市花鳥市場、福州市某鸚鵡繁殖基地和南平動物園進行PBFD的分子流行病學(xué)調(diào)查，針對 PBFDV的 ORF中編碼衣殼蛋白的 C1基因，設(shè)計引物進行 PCR擴增，同時對上述地點的陽性樣本進行Cap基因測序，與GenBank中部分PBFDV毒株的親緣關(guān)系比對，繪制系統(tǒng)進化樹，并進行Cap蛋白抗原表位預(yù)測，以了解福建省PBFDV毒株的情況，為疾病的預(yù)防與診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預(yù)處理

2017—2018年于福州動物園、福州市花鳥市場、福州市某動物救助站、福州市某鸚鵡繁殖基地、三明動物園和南平動物園共采集298份鸚鵡糞便樣品。用棉拭子在待檢糞便樣品上涂抹采樣，裝入含有1‰抗生素的1 mL PBS中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Taq酶、dNTP Mixture、Oligo d(T)18 Primer、PrimeSTAR 高保真酶均購自TaKaRa公司，OMEGA Stool DNA Kit(200)試劑盒購自O(shè)mega公司，膠回收試劑盒購自Vigorous公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的PBFDV序列(登錄號：EF457974)的C1和Cap基因序列設(shè)計特異性引物。引物由廣州擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 引物序列信息

1.4 核酸提取和PCR檢測

病毒核酸提取采用OMEGA Stool DNA Kit(200)試劑盒，操作步驟按說明書進行。用PCR擴增，擴增體系15 μL。PCR反應(yīng)體系為: dNTP(2.5 mmol/L)1.2 μL、10×Buffer 1.5 μL、10×TaqDNA聚合酶 0.1 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、DNA模板 1 μL、水 10.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ～58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 Cap基因的擴增、回收與測序

選取福州市某動物救助站、福州動物園、三明動物園、福州市花鳥市場和福州市某鸚鵡繁殖基地各地陽性樣品，分別命名為FZ-JZZ、FZ-DWY、SM-DWY、FZ-HNSC和FZ-JD，進行PCR擴增(方法同1.4)。在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下所需回收目的DNA條帶，稱重，用Invitrogen Ambion膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的DNA樣本委托廣州擎科生物科技有限公司進行測序。應(yīng)用DNAStar序列分析軟件對所測PBFDV的Cap基因序列與GenBank中的國內(nèi)外一些PBFDV毒株進行同源性比較，用MEGA 5.1軟件繪制系統(tǒng)進化樹。

1.6 PBFDV Cap蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測

通過DNAStar軟件包中的Editseq軟件將測序得到的Cap基因序列翻譯成氨基酸序列，用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法預(yù)測PBFDV FZ株Cap蛋白的二級結(jié)構(gòu)。用Kyte-Doolittle方法分析Cap蛋白的疏水性，用Emini方法分析Cap蛋白的表面可及性，用Karplus-Schulz方法分析Cap蛋白柔韌性，用Jameson-Wolf方法對Cap蛋白的抗原指數(shù)進行預(yù)測，最后綜合評價PBFDV FZ株Cap蛋白的B細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地點采集的鸚鵡糞便樣品中PBFDV的PCR檢測

采集了福州市某動物救助站、福州動物園、三明動物園、福州市花鳥市場、福州市某鸚鵡繁殖基地和南平動物園6個不同地點鸚鵡的298份糞便樣品，通過PCR方法對樣品進行檢測，部分樣品PCR電泳圖見圖1。

M. DNA Marker；- . PBFDV-C1陰性對照；+ . PBFDV-C1陽性對照；1～15.部分樣品

統(tǒng)計結(jié)果見表2，各地鸚鵡的PBFDV的陽性率不同，其中，陽性率高于50%的為福州市某動物救助站和福州動物園，分別為65.17%和64.29%；其余地區(qū)從高到低依次為三明動物園(41.67%)、福州市花鳥市場(30.95%)和福州市某鸚鵡繁殖基地(23.76%)，南平動物園未檢測出陽性樣品。

2.2 不同種類鸚鵡PBFDV分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計

此次分子流行病學(xué)調(diào)查共采集了14種不同鸚鵡的糞便樣品，各品種鸚鵡的PBFDV的陽性率也不同，結(jié)果見表3。鸚鵡樣本數(shù)量在5以上且平均陽性率高于50%的分別是金頭凱克鸚鵡(100%)、非洲灰鸚鵡(55.77%)和紅綠金剛鸚鵡(50%)。

2.3 Cap基因同源性和遺傳演化分析

將5個不同來源的陽性樣品FZ-JZZ、FZ-DWY、SM-DWY、FZ-HNSC和FZ-JD的Cap基因序列與GenBank中國內(nèi)外一些PBFDV毒株進行同源性比較，并繪制系統(tǒng)進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測毒株與GenBank中的參考株之間核酸序列同源性均很高，介于82.4%～97.8%之間。其中福建的5株P(guān)BFDV的同源性為100%，與新西蘭株(AY518913)同源性最近，高達(dá)97.8%，在進化樹上處于同一分支；與國內(nèi)較早報道的青島株(KU596572，GQ386944)及北京株(MG257487)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不在同一分支(圖2和圖3)。

2.4 PBFDV Cap蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

2.4.1 PBFDV Cap蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

結(jié)合Garnier-Robson和Chou-Fasman兩種方法預(yù)測PBFDV Cap蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)形成在1～4、35～46、81～89、130～137和162～167位氨基酸殘基；β折疊分布比較均勻，在16～20、28～34、47～66、73～75、96～101、105～110、114～119、125～129、152～157、168～172、176～179、188～198和203～213位氨基酸殘基。在各β折疊之間存在β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，其中β轉(zhuǎn)角在10～15、24～27、90～93、111～114、140～143、148～151、173～175和182～185位氨基酸殘基；無規(guī)卷曲在68～72、94～95、120～121、158～161和199～201位氨基酸殘基，共16個氨基酸殘基。

2.4.2 PBFDV Cap蛋白親水性分析

用Kyte-Doolittle方法對PBFDV Cap蛋白的親水性進行了分析，Cap蛋白疏水性區(qū)域較少，親水性區(qū)域主要分布在1～26、28～53、65～72、74～99、112～142、144～156、158～167、179～193和201～204位氨基酸殘基，提示這些區(qū)段暴露于表面的幾率較大，作為抗原表位的可能性也更大。

表2 不同地點PBFDV調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計

圖2 不同PBFDV毒株Cap基因同源性分析

圖3 不同PBFDV毒株Cap基因遺傳進化分析表3 不同種類鸚鵡PBFDV調(diào)查統(tǒng)計

種類樣品數(shù)量陽性數(shù)量陽性率/%非洲灰鸚鵡1045855.77暗色錐尾鸚鵡631523.81虎皮鸚鵡381436.84琉璃金剛鸚鵡17847.06青綠頂亞馬遜鸚鵡15746.67緋胸鸚鵡1516.67牡丹鸚鵡13323.08和尚鸚鵡12325.00紅綠金剛鸚鵡8450.00金頭凱克鸚鵡55100.00雞尾鸚鵡4375.00藍(lán)喉金剛鸚鵡2150.00小葵花鳳頭鸚鵡11100.00棕櫚鳳頭鸚鵡100合計29812341.28

2.4.3 PBFDV Cap蛋白的表面可及性分析

用Emini方法分析PBFDV Cap蛋白表面可及性較大的區(qū)域主要是第1～24、31～37、42～48、68～70、77～81、112～127和145～151位氨基酸殘基，其他區(qū)段的呈現(xiàn)在表面的可能性較小或為負(fù)值。

2.4.4 PBFDV Cap蛋白柔韌性分析

用Karplus-Schulz方法對PBFDV Cap蛋白柔韌性進行分析，Cap蛋白柔韌性區(qū)域主要位于第5～15、20～27、43～50、63～72、100～102、110～127、132～136、141～153、155～164、171～174、180～191和200～204位氨基酸殘基，分布較均勻。

2.4.5 PBFDV Cap蛋白B細(xì)胞抗原表位分析

利用Jameson-Wolf方法對PBFDV Cap蛋白的B細(xì)胞抗原表位進行預(yù)測，Cap蛋白存在幾段抗原指數(shù)較高的區(qū)域，提示這些區(qū)域含有潛在優(yōu)勢抗原表位，分別在第5～27、110～127和141～153位氨基酸殘基，其他區(qū)域的抗原性低或表面可及性及親水性偏低。

3 討論

隨著我國經(jīng)濟的持續(xù)快速發(fā)展，人們生活水平的提高，帶動了一些觀賞性禽業(yè)的養(yǎng)殖，如鸚鵡養(yǎng)殖。隨著鸚鵡養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，隨之出現(xiàn)的管理不當(dāng)或氣候及環(huán)境因素等所導(dǎo)致的疾病又制約其規(guī)模養(yǎng)殖的發(fā)展。本文調(diào)查了2017—2018年福建省部分地區(qū)PBFD的流行情況，調(diào)查結(jié)果表明，在298份糞便樣品中PBFDV平均陽性率為41.28%(123/298)，其中福州市某動物救助站的PBFDV陽性率最高(65.17%)，其次為福州動物園(64.29%)，南平市動物園未檢測出陽性樣品。分析原因可能為動物救助站的鸚鵡飼養(yǎng)環(huán)境過于狹小、鸚鵡在運輸條件下產(chǎn)生應(yīng)激等致使鸚鵡免疫力下降，給PBFD的傳播創(chuàng)造了便利的條件，導(dǎo)致動物救助站的陽性率最高。鸚鵡繁殖基地為規(guī)?；B(yǎng)殖場，環(huán)境較為封閉，相對衛(wèi)生條件較好，攜帶病毒較少。各動物園的飼養(yǎng)管理及鸚鵡的引種地不同，導(dǎo)致PBFDV的陽性率也不同。從流行病學(xué)檢測結(jié)果分析，這些地區(qū)PBFDV陽性率與其他同種類全球平均陽性率相似。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，檢測的5個PBFDV毒株Cap基因同源性100%，與新西蘭株(AY518913)親緣關(guān)系較近，均處于同一分支，但與青島株(KU596572，GQ386944)及北京株(MG257487)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不在同一分支，說明福建省的PBFDV基因型可能與其他省的PBFDV在系統(tǒng)發(fā)育上不同。

生物信息學(xué)自20世紀(jì)90年代創(chuàng)建以來，由于其投入少、見效快和起點高的特點，已被充分應(yīng)用于生命科學(xué)多個領(lǐng)域。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響其作為抗原表位的潛力，α螺旋和β折疊的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，起到穩(wěn)定蛋白的作用，不易產(chǎn)生形變，嵌合抗體難度大，成為抗原表位的可能性低，而β轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲更易突出于蛋白表面，且比較松散，容易扭曲，因此該區(qū)域常含有B細(xì)胞的優(yōu)勢抗原表位[18]。由于蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象受二級結(jié)構(gòu)的影響，預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)可以得到許多重要信息[19]。本研究通過生物信息學(xué)及序列分析軟件，在氨基酸一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對PBFDV Cap蛋白的二級結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位進行了分析與預(yù)測。結(jié)果表明，Cap蛋白有豐富的二級結(jié)構(gòu)，進一步通過軟件分析了Cap蛋白的疏水性、表面可及性、柔韌性和Cap蛋白的抗原指數(shù)，最后綜合評價了PBFDV Cap蛋白B細(xì)胞抗原表位，發(fā)現(xiàn)其存在多處抗原指數(shù)較高的區(qū)域，有潛在的B細(xì)胞抗原表位，位于第5～27、110～127和141～153位氨基酸殘基或其附近，結(jié)果為Cap蛋白今后的研究提供一定的預(yù)測和理論指導(dǎo)。

PBFDV雖較少引起鸚鵡大批死亡，有些鸚鵡不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但PBFDV誘導(dǎo)的免疫抑制會導(dǎo)致機體對繼發(fā)性感染的易感性增加，造成宿主免疫抑制，而繼發(fā)性感染通常是造成鸚鵡死亡的原因，從而對鸚鵡養(yǎng)殖帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。Raidal 等[20]報道澳大利亞大多瀕危鸚鵡物種均易受PBFDV的感染，而在我國山東省。吳汝娟等[21]發(fā)現(xiàn)PBFDV的陽性率較高，個別鸚鵡養(yǎng)殖場的PBFDV陽性率高達(dá)100%。目前PBFD仍無有效的治療方法，也沒有保護性疫苗，通常的防控方法是檢測和撲殺，因此建議做好養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生工作，保證合理的養(yǎng)殖密度，避免由于野生鳥類等加快病毒的傳播，真正做到防患于未然，以提高鸚鵡養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。