周慶同，戴之卓，趙素文?

①復旦大學 基礎醫(yī)學院，上海 200032；②上海科技大學 iHuman研究所，上海 201210；③上海科技大學 生命科學與技術學院，上海 201210

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor,GPCR）是人體內最大的一類細胞信號轉導受體家族，幾乎參與所有生命活動，負責調控細胞對光線、氣味、激素、神經遞質、趨化因子等的應答，對維持生命健康具有非常重要的意義[1-2]。GPCR的重要性使其成為最重要的藥物靶標家族之一，在心血管疾病、代謝性疾病、神經相關性疾病、免疫性疾病和癌癥等重大疾病的藥物研發(fā)中扮演著重要的角色。目前靶向GPCR的藥物約500個，占FDA已批準藥物的34%[3-4]?；谛蛄邢嗨菩裕祟惖?00多個GPCR可被分為4個亞家族，分別是視紫紅質受體（A家族）、分泌素受體和黏附受體（B家族）、代謝型谷氨酸受體（C家族）、卷曲受體（F家族）。其中，A家族的受體個數(shù)最多（超過700個），生理功能也最為多樣。目前GPCR研究已獲得10次諾貝爾獎，這也從側面說明它的重要性[5]。

GPCR具有保守的結構特征，即7個跨膜螺旋（seven transmembrane helices, 7TMs），這7個螺旋組成的跨膜結構域將受體分割為胞外N端（N-terminus）、胞內C端（C-terminus）、3個胞外環(huán)（extracellular loops）和3個胞內環(huán)（intracellular loops）。GPCR的胞外區(qū)域在結合激動性信號分子（如氣味、激素、神經遞質、趨化因子）后發(fā)生構象變化，進而引發(fā)跨膜螺旋的運動，特別是第6跨膜螺旋靠近胞內的那部分（intracellular half of TM6）往外翹起。此時激活受體的胞內區(qū)域可招募并結合下游效應蛋白（如G蛋白、β-arrestin等），這些效應蛋白通過環(huán)腺苷酸（cAMP）信號通路、磷脂酰肌醇信號通路和鈣離子信號通路等調節(jié)體內生理活動。

GPCR的激活機制是理解其生理功能及相關疾病成因的必由之路，也是藥物精準研發(fā)的基礎，并一直是該領域研究的核心內容和前沿熱點[6-7]。對GPCR的激活機制研究多關注于單個受體或個別位點，所揭示的激活機制缺乏家族層面的系統(tǒng)總結。目前，伴隨著新的激活現(xiàn)象和特征的發(fā)現(xiàn)，人們對受體激活機制的傳統(tǒng)認識正不斷被突破。

1 GPCR激活機制研究中的方法與創(chuàng)新

GPCR的激活是指激動劑結合引發(fā)的下游效應蛋白的招募。GPCR激活的本質是胞外側激動劑結合和胞內側下游效應蛋白招募的互相耦合、別構通信的過程，即受體從非激活態(tài)到激活態(tài)的構象轉變（圖1）。因此，研究GPCR激活機制不僅需要高精度的GPCR三維結構，而且需要精確描述GPCR構象變化的分析工具?？茖W家經過堅持不懈地努力，對GPCR特別是代表性受體（如β2腎上腺素受體、視紫紅質受體、A2A腺苷受體）的激活過程或方式的理解日益深入，但對家族層面的共同激活機制卻知之甚少。究其原因，一方面是結構被解析的受體數(shù)量仍然有限，另一方面是缺乏可精確描述構象變化的分析工具，顯然僅依靠肉眼觀察或位移測量等傳統(tǒng)方法無法做到準確和系統(tǒng)地研究。以下重點闡述GPCR激活機制研究中的主要方法（表1）與創(chuàng)新點。

圖1 大麻素受體CB1的構象變化（左側為結合拮抗劑時處于非激活時的CB1結構[8]；右側為結合激動劑和G蛋白時處于完全激活態(tài)的CB1結構[9]）

表1 GPCR激活機制的研究方法

1.1 三維結構測定

由于GPCR的表達、純化和結晶都存在極大的困難，GPCR的三維結構一直很難測定。伴隨著GPCR昆蟲表達系統(tǒng)的建立、融合蛋白和熱穩(wěn)定性突變等的引入、高親和力配體的篩選使用、脂立方相（lipidic cubic phase, LCP）膜蛋白結晶技術的發(fā)展[10]，GPCR的X-射線晶體學研究已取得巨大成功。其中代表性的成就有2007年Brian Kobilka和Raymond Stevens等[11]合作解析的第一個人源GPCR-β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor, β2AR）晶體結構，2011年Brian Kobilka等[12]解析的第一個GPCR-G蛋白異源三聚體晶體結構和2015年徐華強等[13]解析的第一個GPCR-βarrestin復合物晶體結構。2017年冷凍電鏡技術被應用到GPCR的結構解析中[14-15]，使GPCR的三維結構測定變得容易。值得欣喜的是，近年來多個GPCR的結構首先被我國科學家解析[8,13,16-26]。

截至2020年9月，GPCR已有超過80個受體的400余個結構被解析，其中A家族有近60個受體的300多個結構被解析。這些結構揭示出各受體在配體結合模式、耦合的G蛋白亞型、激活方式等方面具有明顯差異。依據配體分子的藥理學特性和受體的整體狀態(tài)，這些結構可分為3類：①拮抗劑或反向激動劑結合的非激活態(tài)（inactive state）；②同時結合激動劑和下游效應蛋白（如G蛋白、β-arrestin等）的激活態(tài)（active state）；③只結合激動劑的中間態(tài)（intermediate state）。A家族有多個受體處于非激活態(tài)和激活態(tài)時的結構都已被解析，如牛視紫紅質受體（bRho）、β2腎上腺素受體（β2AR）、 M2毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M2R）、μ阿片受體（μOR）、 A2A腺苷受體（adenosine A2Areceptor, A2AR）和κ阿片受體（κ-OR），為GPCR家族層面的共同激活機制研究提供了良好起點。

1.2 核磁共振和分子動力學模擬

與三維結構測定的穩(wěn)定的靜態(tài)構象不同，核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）能夠在原子分辨率水平研究蛋白質的構象變化，填補了晶體或電鏡結構缺失的信息，為理解GPCR動態(tài)構象變化和激活機制提供全新的視角。NMR在GPCR應用上的主要挑戰(zhàn)是信號弱且雜，設計新穎有效的標記位點頗為耗時耗力。由于GPCR分子較大，NMR只能使用15N選擇性標記一兩種出現(xiàn)頻率不高且結構分布較廣的殘基(如Gly和Trp)[27]，或者使用含有19F的分子來反應性地標記事先選定的與激活關系緊密的一兩個Cys位點[28-30]。隨著高場NMR、改進的低溫探針、穩(wěn)定同位素標記及橫向弛豫優(yōu)化譜（transverse relaxation-optimized spectroscopy, TROSY）等技術的應用，GPCR的NMR研究取得突破性發(fā)展，如鑒定出GPCR存在著多種與功能密切相關的構象狀態(tài)，且受激動劑、拮抗劑、別構調節(jié)劑和下游效應蛋白等調控[27-28,31]。

借助于不斷優(yōu)化的分子力場和計算機軟硬件，分子動力學模擬已被廣泛應用于生物大分子的結構和動態(tài)特性研究，在GPCR研究中正發(fā)揮著日益重要的作用[32-33]。分子動力學模擬使人們得以了解藥物分子如何進入結合口袋并激活受體，跨膜信號如何轉導，藥物的偏向性信號通路如何實現(xiàn)，膽固醇等脂質分子如何影響受體激活等重要問題，也為GPCR的藥物設計和激活機制研究提供重要的研究工具。GPCR嵌膜模擬體系通常含原子數(shù)較多，模擬時間一般在微秒水平，無法覆蓋GPCR的整個激活過程，且不同受體的激活過程也會略有差異，因此通過分子動力學模擬研究家族層面的GPCR激活機制仍有較大困難。

1.3 殘基接觸

GPCR激活的本質是局部殘基間相互作用的改變誘發(fā)螺旋位置的變化，因此有必要開發(fā)計算方法來描述殘基間相互作用從非激活態(tài)到激活態(tài)的轉變，進而比較各受體在激活時的殘基作用改變的異同，最終建立家族層面的共同激活機制。2016年英國劍橋MRC-MLB的Madan Babu課題組，使用殘基接觸（residue contact, RC）來研究GPCR的激活機制。殘基接觸的定義是：若兩殘基有原子對間距離減去其范德華半徑之和小于0.5 ?，即認為兩殘基間存在接觸，否則兩殘基間沒有接觸[34]。對A家族GPCR中同時有激活和非激活態(tài)結構的5個受體10個結構進行殘基接觸分析，研究人員發(fā)現(xiàn)有6組殘基對在這5個受體激活過程中具有一致的殘基接觸變化，即同時消失或形成。其中，2組殘基對（3×46—7×53和5×55—6×41）在激活后新形成接觸，余下的4組殘基對（1×53—7×53，3×46—6×37，7×53—8×50和7×54—8×51）則在激活后接觸消失。這里殘基編號采用GPCRdb命名法[35]：將每個α螺旋上序列最保守的殘基定為×50，其他殘基依據與×50在序列上的相對位置依次命名，如3×49即為第3個α螺旋上、在序列上位于最保守位點3×50的前一位，而3×51則為第3個α螺旋上、在序列上位于最保守位點3×50的后一位。結合A家族其他結構的驗證，他們發(fā)現(xiàn)靠近G蛋白結合區(qū)域的兩組殘基對（3×46—6×37和3×46—7×53）具有家族普遍性，即A家族GPCR激活時都有這樣的構象接觸變化，因此A家族GPCR被認為具有多樣化的激活通路，且這些激活通路僅收斂于G蛋白結合區(qū)域。這一工作為GPCR激活機制研究提供了全新的計算思路，但其揭示的共同激活機制卻遺漏了一系列保守的特征基序（motif，序列中局部的保守區(qū)域），如CWxP[27,36]、PIF[37-38]、DRY[39-40]、鈉離子結合口袋等[27,41]，也無法解釋TM6末端因何翹起，因此GPCR的共同激活機制仍有待于完善。

受到配體-殘基相互作用定量描述的啟發(fā)[42]，我們提出殘基接觸打分（residue-residue contact score, RRCS）用以精確描述殘基對間的接觸強度[43]，將三維的、復雜的結構信息轉化為二維的、量化的殘基接觸打分，同時殘基接觸分差（ΔRRCS = RRCSactive-RRCSinactive）可精確描述受體激活過程中的殘基構象變化。殘基接觸打分完全從蛋白質結構本身出發(fā)，不依賴于蛋白質結構比對（alignment），且可將整體和局部、顯著和微小的構象變化系統(tǒng)地劃分為開關（switching）和重排（repacking）、螺旋間（inter-helical） 和螺旋內（intra-helical）等兩個層面的4種類型。為遴選出A家族GPCR激活時都具有的保守的構象變化，我們首先分析6個受體（bRho、β2AR、M2R、μOR、A2AR和κ-OR）在激活過程中的殘基接觸分差。一方面，檢查這些殘基對在6個受體中是否有統(tǒng)一的構象變化，即殘基接觸分差皆為正或負；另一方面，研究這些殘基對的接觸打分，在家族層面的非激活與激活態(tài)間是否存在顯著性差異（142個非激活態(tài)結構和27個激活態(tài)結構）。我們最終發(fā)現(xiàn)在A家族GPCR激活時，有34組殘基對具有保守的構象變化。

2 GPCR的共同激活機制

2.1 A家族GPCR的共同激活機制

基于家族保守的、激活時具有統(tǒng)一構象變化的34組殘基對，我們構建起A家族GPCR的共同激活通路（圖2）。這34組殘基對由35個殘基構成，有機連接和整合了人們熟知的、序列保守但空間疏離的特征基序，如CWxP[27,36]、PIF[37-38]、DRY[39-40]、鈉離子結合口袋等[27,41]和NPxxY[12,34]等，在殘基水平上回答GPCR如何被激活，TM6為什么會翹起，各基序如何協(xié)同作用實現(xiàn)GPCR的跨膜信號轉導。需要指出的是，這一通路是A家族不同受體在不同激動劑或不同下游效應蛋白時的共同部分，每個受體仍然具有獨特的、受體/配體/效應蛋白特殊的激活通路。

依據這35個殘基的空間位置和功能，我們將GPCR的共同激活通路由胞外到胞內共劃分為4層（圖2（a））：①信號啟動層；②疏水鎖層；③微型開關傳遞層；④胞內效應蛋白結合層。激動劑的結合誘發(fā)配體結合口袋發(fā)生構象變化，最終引起位于胞內口袋底部的特征基序CWxP、PIF發(fā)生結構重排，使得鈉離子結合口袋坍塌，最終實現(xiàn)信號啟動。第二層疏水鎖層殘基在接收到第一層的啟動信號后，幾個疏水殘基構成的疏水鎖（6×41—3×43 和 6×40—3×43）被打開，分別通過TM6和TM7傳遞激活信號。第三層由2個微型開關殘基（6×37和7×53）控制，在接受到疏水鎖層的信號后發(fā)生劇烈的構象變化，形成或破壞了一系列的殘基接觸使得信號得以放大。第四層則將上述構象變化通過結合胞內效應蛋白傳遞到胞內，最終通過第二信使cAMP、IP3和Ca2+等實現(xiàn)信號轉導。綜上，4層殘基互相配合，通過螺旋間/螺旋內的殘基開關或重排實現(xiàn)GPCR的跨膜信號轉導。

為表征跨膜螺旋的整體構象變化，我們選擇TM3和TM6間的所有4組殘基對來計算2個螺旋間的接觸分，即RRCSTM3-TM6，類似地還有RRCSTM3-TM7和RRCSTM5-TM6。在將142個非激活態(tài)結構和27個激活態(tài)結構投影到由RRCSTM3-TM6和RRCSTM3-TM7組成的二維空間時，我們發(fā)現(xiàn)GPCR的激活態(tài)和非激活態(tài)具有迥然不同的結構特征（圖2（b））。激活態(tài)的RRCSTM3-TM6為零，而RRCSTM3-TM7通常大于5；非激活態(tài)的RRCSTM3-TM7通常接近或等于零，而RRCSTM3-TM6分布廣泛但通常大于零。這充分說明GPCR激活時具有共同的整體構象變化，即激動劑的結合觸發(fā)TM6胞內段往外運動從而遠離TM3，這使得TM7可以往內運動從而靠近TM3，最終在受體的胞內側形成空隙以結合G蛋白等下游效應蛋白。值得注意的是，此前研究者在使用肉眼觀察受體結構來判斷激活狀態(tài)時，常過分關注TM6翹起與否，圖2（b）告訴我們非激活態(tài)最保守的特征其實是TM3與TM7之間的遠離，而在激活態(tài)中，TM3與TM7的殘基之間具有廣泛的接觸。因此，我們認為，TM7的運動盡管不如TM6劇烈，同樣是GPCR激活所必需。

從序列角度看，A家族GPCR共同激活通路上的35個殘基具有較強的序列保守性，與之對應的是配體結合區(qū)域和G蛋白耦合區(qū)域的殘基組成非常多樣。我們認為，GPCR共同激活通路中的殘基構成一個負責激活的模塊，解放出配體結合區(qū)域和G蛋白耦合區(qū)域來快速演化。這或許是GPCR可以使用一個簡單的折疊模式來實現(xiàn)如此多樣化功能的一個原因。

圖2 A家族GPCR的共同激活機制[43]：（a）殘基水平的共同激活通路，由在激活時具有保守構象變化的34組殘基對構成；（b）激活時跨膜螺旋的構象變化

2.2 激活機制指導的組成性突變設計

GPCR的激活需要共同激活通路上各殘基的參與，因此理論上可對這些關鍵殘基進行干擾以實現(xiàn)激活信號的關閉或開啟。為此，我們對共同激活通路上的殘基進行理性突變設計以便將受體鎖定激活構象或非激活構象，這樣受體將處于組成性激活（不需要激動劑即可產生激活信號）或失活（即使有激動劑也不產生激活信號）。A2A腺苷受體是研究較多的A家族GPCR，它耦合激活型G蛋白（G），在結合激動劑后激活cAMP通路使得胞內cAMP含量增加。我們以A2A腺苷受體為例進行理性設計，最終證實15個設計的組成性激活突變中的6個、20個設計的失活突變中的15個都被cAMP功能實驗證實，且它們的配體結合能力基本不受突變影響，這充分說明這些位點在GPCR激活過程中扮演著重要角色。此外，我們還對耦合抑制型G蛋白（Gi）的5-羥色胺受體1B（5-HT1B）和耦合激活型G蛋白的5-羥色胺受體7（5-HT7）進行基于GPCR共同激活通路的突變設計，實驗證實這些突變體具有類似的組成性激活或失活效應。

2.3 激活機制與致病突變

GPCR的正常運作對于維持人體健康至關重要。GPCR的某些氨基酸突變可能會使GPCR功能紊亂并導致尿崩癥、甲狀腺功能亢進、性腺功能減退癥、糖皮質激素缺乏癥等遺傳學疾病[44]。為了研究GPCR信號轉導與疾病的關聯(lián)，我們從數(shù)據庫和文獻上共收集人類GPCR的435個疾病相關突變，發(fā)現(xiàn)其中有25%的突變發(fā)生在GPCR的共同激活通路上，這一比例顯著高于配體結合區(qū)域（20%）或G蛋白結合區(qū)域（7%）。從突變發(fā)生率看，致病突變明顯富集在共同激活通路上，比配體結合區(qū)域高2.5倍，比G蛋白結合區(qū)域高3.5倍。實際上，GPCR的共同激活通路也為我們理解致病突變機制提供思路，如血管加壓素V2受體（vasopressin V2 receptor,V2R）的I1303×43N突變會使得受體成為組成型激活，導致腎原性抗利尿激素分泌失調綜合征（N-SIAD）[45]。I1303×43F則使受體失活，產生腎原性尿崩癥（NDI）[46]。這可能是由于I130N/F會削弱/增加疏水鎖的穩(wěn)定性，削弱/增強TM3與TM6間的作用，使受體的TM6更易/難翹起，導致受體處于激活/失活狀態(tài)，再經過下游信號通路的放大和轉導，最終導致疾病的產生。

3 展望

GPCR激活機制是理解GPCR功能和理性藥物設計的鑰匙。伴隨著過去20年GPCR結構解析的巨大發(fā)展，以及單分子、單殘基甚至單原子分析技術的不斷進步，我們對GPCR的認識日益深入，對配體激活受體、受體耦合G蛋白等關鍵問題也有了更豐富的認知，但距離全面理解GPCR的激活機制（家族共性和受體個性）仍有相當距離。從藥物研發(fā)角度看，如何設計藥物以精細調控GPCR的信號轉導輸出，如偏向性信號通路、亞型選擇性、藥物效率等重大問題，都繞不開GPCR的激活機制?？傊?，GPCR的激活機制研究內涵深刻，任重而道遠，需要科研工作者們的不懈努力。