沈靈，華甜?，劉志杰??

①上?？萍即髮W(xué) iHuman研究所，上海 201210；② 上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210

1 大麻及大麻素

大麻隸屬于植物界的被子植物門(mén)雙子葉植物綱蕁麻目桑科大麻屬。在沒(méi)有被人類廣泛使用前，大麻主要分布于印度、不丹和中亞細(xì)亞，目前在很多國(guó)家和地區(qū)均可以合法種植。大麻在醫(yī)藥、宗教、靈學(xué)和娛樂(lè)等領(lǐng)域均有較長(zhǎng)的使用歷史，是一種在人類早期就開(kāi)始種植的物種。據(jù)史料記載，大麻這一古老的藥用植物從公元200年前就一直作為治療多種疾病的植物藥使用[1]。

大麻/大麻素（marijuana/cannabinoid）在20世紀(jì)中后期就已經(jīng)成為主流科學(xué)的研究目標(biāo)，國(guó)際上很多科研機(jī)構(gòu)均開(kāi)始了對(duì)大麻素作用機(jī)制和藥用價(jià)值的研究。大麻中含有上百種活性化合物，這些化合物被統(tǒng)稱為植物性大麻素。其中的主要成分包括具有精神活性的四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol, THC）[2]和非精神活性的大麻二酚（cannabidiol, CBD）等。由于THC可以使人成癮，聯(lián)合國(guó)公約和許多國(guó)家的法律均把大麻列為“麻醉品”或“毒品”，對(duì)大麻的態(tài)度基本是采取限制、管制和監(jiān)察的措施。研究顯示，人類攝入THC含量小于0.3%不顯示精神活性，可以作為工業(yè)大麻添加使用，但是攝入THC含量大于0.3%則具有一定的藥用和濫用傾向[3-4]。因此，出于安全因素考慮，近年來(lái)各國(guó)普遍采用歐盟（農(nóng)業(yè)）委員會(huì)制定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，即控制工業(yè)大麻原料干品的THC含量小于0.3%。目前大麻在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的重要作用已經(jīng)得到更加廣泛的研究和認(rèn)可，THC和CBD在國(guó)外已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研究中。例如，2018年分別被歐盟EMA和美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市治療兒童癲癇病的新藥“Epidiolex”中的主要有效成分就是大麻中的CBD。

與大麻素相關(guān)的化合物是一類結(jié)構(gòu)和功能多樣的化學(xué)物質(zhì)，具體可分為以下三個(gè)大類（表1）。①植物性大麻素：從植物大麻中提取，具有可令人產(chǎn)生亢奮、幻覺(jué)及愉悅感的THC等。我國(guó)早期的藥書(shū)《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》[5]中就有關(guān)于植物性大麻素的醫(yī)藥和保健用途的大量記載，包括用其治療便秘、瘧疾和疼痛等。 在20世紀(jì)40年代，Todd和Adams分離出了一種具有弱神經(jīng)作用的成分CBD[6-7]，從此對(duì)大麻的研究才真正開(kāi)始。但是直到1964年，科學(xué)家才首次分離和合成出大麻的主要活性成分THC，為之后化學(xué)家設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)類似物及新型合成類大麻素提供了分子基礎(chǔ)。②內(nèi)源性大麻素：由生物體內(nèi)自身合成產(chǎn)生，主要是一些酰胺、脂類，或細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)前體被某些酶催化加工后的脂類化合物[8]。它們均具有與植物性大麻素THC相似的三維結(jié)構(gòu)。③合成型大麻素：由實(shí)驗(yàn)室或者工業(yè)合成，具有植物性大麻素和內(nèi)源性大麻素的部分或全部生理特性，是天然大麻素的輔品或者替代品。一些合成型大麻素對(duì)大麻素受體的激活或拮抗能力比天然大麻素強(qiáng)4～5倍，甚至可以高百倍以上。因此這些合成型大麻素和天然大麻素相比會(huì)對(duì)人體的一些生理系統(tǒng)與器官，如神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)（腸胃）、心血管系統(tǒng)等有毒副作用[9]。但是，天然及合成大麻素如果嚴(yán)格按照藥物評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行研發(fā)，那么它們?cè)谥委熖弁?、抑郁癥、癲癇癥、焦慮、癌癥、免疫類相關(guān)疾病，以及肥胖癥等方面具有較好的應(yīng)用前景。

表1 經(jīng)典大麻素的有效成分以及功能簡(jiǎn)介

2 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system,ECS/eCBs）在人體內(nèi)廣泛分布，主要由內(nèi)源性大麻素N-花生四烯酸乙醇胺（anandamine,AEA）和2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol, 2-AG），以及與它們相互作用的受體和負(fù)責(zé)合成代謝及降解內(nèi)源性大麻素的酶（fatty acid amide hydrolase, FAAH; monoacylglycerol lipase, MAGL）所組成[10]。ECS在整個(gè)大腦中的表達(dá)方式多種多樣，它們涉及神經(jīng)傳遞、記憶形成和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)和微調(diào)，同時(shí)在神經(jīng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用。在神經(jīng)通路、神經(jīng)元或者其他類型的細(xì)胞中，這些小分子、酶或者一至兩種大麻素受體共同作用形成的ECS，可以發(fā)揮不同的生理功能[11]，其中包括學(xué)習(xí)、記憶、炎癥、食欲、消化、能量平衡、代謝、睡眠周期、壓力、情緒和成癮等[12]，因此ECS中的很多重要組分均是潛在的藥物靶點(diǎn)。

3 大麻素受體CB1和CB2及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

目前已知的大麻素受體（cannabinoid receptor）屬于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor, GPCR）中的Class A家族，主要包括大麻素受體亞型I（cannabinoid receptor type 1, CB1）和大麻素受體亞型II（cannabinoid receptor type 2, CB2）。CB1和CB2具有44%的序列同源性[13]，其中CB1主要分布在腦區(qū)的大腦皮層、海馬、小腦和基底核等[14]，同時(shí)在脊髓和外周神經(jīng)系統(tǒng)中也有少量分布，所以CB1又被稱為中樞型大麻素受體。它的激活可以降低神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，例如多巴胺，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)認(rèn)知、記憶和運(yùn)動(dòng)控制等。CB2則主要在外周免疫系統(tǒng)高表達(dá)，例如扁桃體、胸腺免疫細(xì)胞和脾臟邊緣區(qū)等，所以CB2又被稱為外周型大麻素受體，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)內(nèi)外因子的釋放和免疫性細(xì)胞的遷徙中發(fā)揮重要作用[15]。CB1和CB2均可調(diào)節(jié)化學(xué)遞質(zhì)的釋放，不過(guò)CB1的主要來(lái)源是神經(jīng)細(xì)胞，CB2則來(lái)源于免疫細(xì)胞。

大麻素受體CB1和CB2主要通過(guò)與G蛋白Gi/o亞型偶聯(lián)進(jìn)行下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)受體結(jié)合激動(dòng)劑后，會(huì)抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的環(huán)化腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）降低[16]。CB1在某些特定條件下，激動(dòng)劑與受體結(jié)合后，也會(huì)與G蛋白Gs[17]或者Gq[18]亞型偶聯(lián)并介導(dǎo)下游信號(hào)傳遞。近年來(lái)的研究表明，大麻素受體CB1和CB2也可以通過(guò)阻遏蛋白（arrestin）介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，廣泛地參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)，調(diào)節(jié)與G蛋白不同的生理功能。大麻素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)，因此是非常重要的藥物靶點(diǎn)[19]。

4 大麻素受體CB1的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

人源大麻素受體CB1于1990年被成功克隆，由472個(gè)氨基酸組成，屬于GPCR Class A家族的α分支。2016年，第一個(gè)CB1與拮抗劑AM6538復(fù)合物的2.8 ?（1 ? = 10-10m）晶體結(jié)構(gòu)被成功解析[20], 隨后CB1與拮抗劑Taranabant的三維結(jié)構(gòu)也得到解析[21]。CB1與AM6538及CB1與Taranabant復(fù)合物的三維精細(xì)結(jié)構(gòu)揭示了受體的重要結(jié)構(gòu)特征以及與拮抗劑結(jié)合的關(guān)鍵相互作用（圖1（a、b））。整體結(jié)構(gòu)顯示，CB1具有GPCR典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)，由胞內(nèi)3個(gè)loop（ICLs）和胞外3個(gè)loop（ECLs）以及第8個(gè)螺旋（Helix 8）組成。CB1的N端構(gòu)象比較特殊，在拮抗劑配體的識(shí)別中起到了關(guān)鍵作用。具體而言，CB1的N端（99～112）氨基酸殘基形成V型環(huán)并從垂直于細(xì)胞膜方向插入CB1的結(jié)合口袋，像一個(gè)塞子將結(jié)合口袋封閉。在已解析的與CB1同源性較高的脂類受體S1P1[22-23]（sphingosine-1-phosphate receptor 1）和LPA1（lysophosphatidic acid receptor 1）[24]中，它們的N端也形成有序的螺旋構(gòu)象并從上方將結(jié)合口袋封閉，從而形成疏水的配體結(jié)合口袋，有利于配體的結(jié)合。之前的研究論文表明CB1的胞外第二個(gè)環(huán)（ ECL2）在蛋白表達(dá)、功能以及配體結(jié)合方面都非常重要[25]。CB1的晶體結(jié)構(gòu)中顯示由21個(gè)氨基酸組成的ECL2折疊形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)，其中有4個(gè)氨基酸（268～271）插入結(jié)合口袋中。據(jù)報(bào)道，這4個(gè)氨基端對(duì)于介導(dǎo)某些特定配體的相互作用至關(guān)重要，而ECL2中的兩個(gè)半胱氨酸（Cys257、Cys264）形成的二硫鍵約束了整個(gè)ECL2的構(gòu)象。

2017年Nature雜志發(fā)表了CB1分別與兩種新型激動(dòng)劑小分子AM11542和AM841復(fù)合物的三維精細(xì)結(jié)構(gòu)[26]（圖1（c、d））。該結(jié)構(gòu)不僅揭示了激動(dòng)劑小分子與CB1的相互作用模式，更重要的是，與之前解析的CB1-AM6538復(fù)合物的結(jié)構(gòu)相比，CB1在激動(dòng)劑小分子的調(diào)控下發(fā)生了很大的構(gòu)象變化。CB1的N端以及七次跨膜螺旋的構(gòu)象變化幅度在以往解析的GPCR結(jié)構(gòu)中是最大的。同時(shí)，結(jié)合口袋體積發(fā)生了約53%的變化（激動(dòng)劑的結(jié)合口袋體積為383 ?3，拮抗劑的結(jié)合口袋體積為821 ?3）。這些結(jié)構(gòu)特征也從分子水平解釋了為什么CB1可以與多種不同類型的配體相互作用，參與和調(diào)控人體中很多非常重要的生理活動(dòng)。CB1與激動(dòng)劑復(fù)合物結(jié)構(gòu)揭示的另一重要發(fā)現(xiàn)是，首次從三維結(jié)構(gòu)上觀測(cè)到兩個(gè)氨基酸（Phe2003.36/Trp3566.48）在CB1激活過(guò)程中的協(xié)同構(gòu)象變化，共同啟動(dòng)CB1的激活過(guò)程，被稱之為“雙耦合開(kāi)關(guān)”（twin toggle switch）。在此之前，人們觀測(cè)到的GPCR激活大多只需要一個(gè)氨基酸Trp6.48參與。CB1的“雙耦合開(kāi)關(guān)”可能與其特殊的激活機(jī)制密切相關(guān)。

近年來(lái)隨著冷凍電鏡技術(shù)的突破，GPCR和下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)也得到了解析。2019年Krishna等人[27]解析了基于吲哚合成的大麻素MDMB-Fubinaca（FUB）結(jié)合的CB1-Gi的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，揭示了吲哚類激動(dòng)劑對(duì)CB1的激活機(jī)制以及與G蛋白的相互作用模式（圖1（e））。但是基于THC衍生物的激動(dòng)劑是如何激活CB1受體以及與G蛋白的偶聯(lián)機(jī)制仍然不是很清楚。2020年在Cell雜志上發(fā)表的CB1-AM841-Gi的結(jié)構(gòu)有進(jìn)一步描述和解釋[28]。如圖1（f）所示，CB1-AM841-Gi的總體結(jié)構(gòu)類似于我們之前解析的與AM841結(jié)合的CB1晶體結(jié)構(gòu)[26]，主要差異發(fā)生在CB1和G蛋白界面上，其中相互作用殘基由Gi穩(wěn)定，同時(shí)TM5的延長(zhǎng)和TM5、TM6、ICL1和ICL2在細(xì)胞區(qū)域里的向內(nèi)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致與Gαi蛋白結(jié)合的α5發(fā)生更多的極性和疏水相互作用[28]，而且在晶體結(jié)構(gòu)中我們提到的雙耦合開(kāi)關(guān)依舊在復(fù)合物結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)打開(kāi)的狀態(tài)，可見(jiàn)它們?cè)贑B1的激活過(guò)程中非常重要。

已經(jīng)獲得的多種CB1結(jié)構(gòu)（非活性狀態(tài)、激動(dòng)劑結(jié)合的類活化狀態(tài)和活化狀態(tài)）揭示了重要的構(gòu)象多樣性，并為我們提供了解密大麻素受體激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可以看出CB1在不同狀態(tài)之間的過(guò)渡過(guò)程中具有可塑性，揭示了CB1能夠結(jié)合不同類型配體的分子理論依據(jù)。

5 大麻素受體CB2的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

圖2 大麻素受體CB2與不同配體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)：（a）CB2-AM10257晶體結(jié)構(gòu)（粉色螺旋表示CB2，粉色球棍狀表示AM10257）；（b）CB2-AM12033晶體結(jié)構(gòu)（藍(lán)綠色螺旋表示CB2，藍(lán)綠色球棍狀表示AM12033）；（c）CB2-AM12033-Gi復(fù)合物電鏡結(jié)構(gòu)（綠色螺旋表示CB2，綠色球棍狀表示AM12033，黃色表示Gαi亞基，青色表示Gβ亞基，粉色表示Gγ亞基）；（d）CB2-WIN-55,212-2-Gi復(fù)合物電鏡結(jié)構(gòu)（紫色螺旋表示CB2，紫色球棍狀表示W(wǎng)IN-55,212-2，橙色表示Gαi亞基，青色表示Gβ亞基，粉色表示Gγ亞基）

Munro等人[15]于1993年首次從HL60細(xì)胞中克隆出大麻素受體CB2基因。CB2主要在免疫系統(tǒng)中表達(dá)，近幾年人們逐漸認(rèn)識(shí)到CB2在免疫調(diào)節(jié)、炎癥、神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)炎和神經(jīng)退行性疾病治療中的潛在作用。人源大麻素受體CB2與拮抗劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)于2019年首次獲得解析[29]（圖2（a）），2.8 ?分辨率的晶體結(jié)構(gòu)清晰地揭示了CB2與拮抗劑AM10257的相互作用模式。研究者通過(guò)與CB1三維結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)同處于拮抗?fàn)顟B(tài)下的CB2與CB1結(jié)構(gòu)差別很大。兩個(gè)受體靠近胞內(nèi)的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)均為收緊的狀態(tài)，但是靠近胞外的跨膜區(qū)包括N端的構(gòu)象發(fā)生了很大變化。CB2 N端的10個(gè)氨基酸殘基在配體分子結(jié)合口袋的上方形成一段較短的螺旋，不像CB1的N端是形成V型loop插入結(jié)合口袋并參與小分子配體的相互作用。CB2接近胞外的跨膜區(qū)相比于CB1更加收緊，CB2的TM1、TM2、ECL2和ECL3都向其結(jié)構(gòu)中心收攏。與CB1類似，ECL2內(nèi)部也形成一對(duì)二硫鍵（Cys174、Cys179）[29]穩(wěn)定ECL2的構(gòu)象。意外的是，拮抗劑結(jié)合的CB2反而與激動(dòng)劑結(jié)合的CB1結(jié)構(gòu)具有更高的相似性。

CB2的激動(dòng)劑已經(jīng)被證明可以有效地緩解炎癥導(dǎo)致的疼痛、神經(jīng)性疼痛和眼科疾病等[30-31]。然而，大部分的大麻素受體激動(dòng)劑選擇性差，會(huì)同時(shí)作用于兩個(gè)受體，引起因作用于CB1而產(chǎn)生的精神副作用。2020年初Cell上報(bào)道了CB2與激動(dòng)劑AM12033的晶體結(jié)構(gòu)[28]（圖2（b））。該結(jié)構(gòu)與拮抗劑結(jié)合的CB2結(jié)構(gòu)非常相似，激動(dòng)劑AM12033和拮抗劑AM10257在CB2中的結(jié)合口袋也高度相似，僅僅是TM1、TM4和TM7的胞外部分向內(nèi)微小運(yùn)動(dòng)形成了一個(gè)更緊湊的激動(dòng)劑結(jié)合口袋。與激動(dòng)劑結(jié)合的CB2和CB1在胞外跨膜區(qū)部分的結(jié)構(gòu)也較為相似，而胞內(nèi)部分CB1表現(xiàn)出了部分激活特征，CB2則仍處于非激活狀態(tài)。正是因?yàn)镃B1和CB2在結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異，造成了兩個(gè)大麻素受體在功能上的區(qū)別[28]。結(jié)構(gòu)顯示，CB1和CB2的激動(dòng)劑結(jié)合口袋非常相似，包括結(jié)合方式和關(guān)鍵氨基酸，這也從結(jié)構(gòu)上解釋了大麻素受體激動(dòng)劑選擇性差的原因。

CB2和CB1一樣主要通過(guò)與Gi/o蛋白偶聯(lián)來(lái)抑制腺苷酸環(huán)化酶和cAMP信號(hào)傳導(dǎo)而引起生理反應(yīng)。與CB1-Gi復(fù)合物相比，CB2-AM12033-Gi復(fù)合物的結(jié)構(gòu)顯示出相似的相互作用方式，CB2和Gi之間的接觸是通過(guò)Gαi亞基廣泛介導(dǎo)的，主要相互作用界面由受體的TM3、TM5、TM6和ICL2以及Gαi亞基的α5螺旋、αN螺旋和αN-β1環(huán)組成[28]（圖2（c））。與其他已解析的GPCR與Gi復(fù)合物的結(jié)構(gòu)比較，CB2和CB1的TM5更加延伸，與Gαi亞基的α5螺旋形成更多的相互作用。通過(guò)CB1-AM841-Gi和CB2-AM12033-Gi復(fù)合物結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)ICL2可能是影響兩個(gè)受體對(duì)不同G蛋白的選擇性的因素之一。同期Cell報(bào)道了激動(dòng)劑WIN55,212-2結(jié)合的CB2-Gi的復(fù)合物結(jié)構(gòu)[32]（圖2（d）），由于與大多數(shù)CB1和CB2激動(dòng)劑不同，WIN 55,212-2在不引起CB2內(nèi)化的情況下激活G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑，該性質(zhì)被認(rèn)為避免了藥物耐受性的發(fā)展。這些結(jié)果提供了有意義的信息，從分子水平揭示了CB2與配體的相互作用以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，將有助于合理設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)具有高親和力和選擇性的靶向CB2的小分子藥物。

6 結(jié)論與展望

由于在疼痛、肥胖、炎癥、癌癥和各種精神類疾病中的治療潛力，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)一直以來(lái)就是一個(gè)極具吸引力的研究領(lǐng)域。然而大麻素受體CB1的正構(gòu)激動(dòng)劑發(fā)展成安全有效的藥物需要突破成癮或抑郁等副作用的壁壘，而CB2的配體尤其是正構(gòu)激動(dòng)劑則需要增強(qiáng)其特異性以避免觸發(fā)CB1或者其他潛在大麻素受體的活性。雖然近幾年關(guān)于CB1和CB2的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究取得了一系列突破性進(jìn)展，加深了人們對(duì)配體作用方式和機(jī)制的理解，但是進(jìn)一步研究探索既沒(méi)有副作用又可以有效阻斷大麻素引起的過(guò)度反應(yīng)，繼而提高大麻素類藥物治療指數(shù)的配體仍然至關(guān)重要。本文概述了有關(guān)大麻素以及內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的一些特性，總結(jié)了大麻素受體的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)讓我們對(duì)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)有了基本的理解，希望將來(lái)可以從原子、分子、細(xì)胞甚至動(dòng)物水平進(jìn)一步研究不同配體對(duì)大麻素受體的調(diào)控機(jī)制，為設(shè)計(jì)優(yōu)化更加高效和安全的藥物提供指導(dǎo)。