魏成威，劉 琳，王新宇，白 薈，高 利*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物臨床教學醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

腸球菌是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、無芽孢的兼性厭氧菌，是溫血動物和人類胃腸道的共生菌[1]。糞腸球菌和屎腸球菌是其中的兩大類，被認為是引起人類醫(yī)院內(nèi)感染的主要原因[2]。屎腸球菌曾被認為對人類及動物機體是無害的，并且很長一段時間內(nèi)在食品工業(yè)中作為益生菌等添加物被廣泛使用[3]。近年來的研究顯示,屎腸球菌作為條件致病菌在腸道抵抗力降低及長期患病(如腎臟疾病、腫瘤等)致免疫力低下時可引起人和動物發(fā)病[4]。在美國，腸球菌是醫(yī)院內(nèi)感染的第二大原因，糞腸球菌和屎腸球菌分別占每年感染的6.8%和4.1%[5]。動物感染屎腸球菌因種屬不同及個體差異表現(xiàn)不同的癥狀。

本研究從病死狐的肺部分離到1菌株，經(jīng)形態(tài)學檢查、16S rRNA鑒定、藥敏試驗、毒力基因檢測及致病性試驗確定為屎腸球菌感染。狐貍是一種重要的經(jīng)濟動物，但是國內(nèi)對于狐感染屎腸球菌的報道很少，通過藥敏試驗和動物試驗來確定該菌臨床用藥的敏感性和致病性，為該病臨床治療和流行病學調(diào)查提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來源于某狐貍養(yǎng)殖場送檢到獸醫(yī)院的死亡狐貍，從肺臟中采集的組織。

1.1.2 實驗動物 SPF小鼠7只，購自遼寧長生生物有限公司。

1.1.3 試劑和儀器 血平板，南京—基生化有限公司產(chǎn)品；rTaq酶、10×PCR buffer、dNTP，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，北京索萊寶生物有限公司產(chǎn)品；DHP-360電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司產(chǎn)品；DYY-Ⅲ型電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成 16S rRNA的片段長度為1 500 bp，上游引物27F，引物序列為5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'，下游引物1429R，引物序列為5'GGTTACCTTGTTACGACTT3'，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

屎腸球菌的毒力基因cyt的片段長度為475 bp，上游引物為CYT-1，引物序列為5'ACTCGGGGATTGATAGGC3'，下游引物為CYT-2，引物序列為5'GCTGCTAAAGCTGCGCTT3'；屎腸球菌種屬基因包含hyl、asa、ace、gel、esp、tuf，基因hyl片段長度為276 bp，上游引物為HYL-1，引物序列為5'ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG3，下游引物為CYT-2，引物序列為5'GACTGACGTCCAAGTTTCCAA3'；基因asa片段長度為375 bp，上游引物為ASA-11，引物序列為5'GCACGCTATTACGAACTATGA3'，下游引物為ASA-12，引物序列為5'TAAGAAAGAACATCACCACGA3'；基因ace片段長度為320 bp，上游引物為ace1-F，引物序列為5'AAAGTAGAATTAGATCACAC3'，下游引物為ace2-R，引物序列為5'TCTATCACATTCGGTTGCG3'；基因gel片段長度為213 bp，上游引物為GEL-11，引物序列為5'TATGACAATGCTTTTTGGGAT 3'，下游引物為GEL-12，引物序列為5'AGATGCACCCGAAATAATATA3'；基因esp片段長度為510 bp，上游引物為Esp-14F，引物序列為5' AGATTTCATCTTTGATTCTTGG3'，下游引物為Esp-12R，引物序列為5'AGATGCACCCGAAATAATATA3'；基因tuf片段長度為112 bp，上游引物為tuf-F，引物序列為5'TACTGACAAACCATTCATGATG3'，下游引物為tuf-R，引物序列為5'AACTTCGTCACCAACGCGAAC3'。

1.2.2 細菌的分離與生化鑒定 用滅菌的接種環(huán)蘸取少許病狐的肺部組織，劃線接種于血清LB平板、麥康凱平板，血瓊脂平板中，37 ℃溫箱中培養(yǎng)18 h～24 h。觀察細菌生長情況和菌落特征并進行革蘭氏染色，接種于發(fā)酵管中進行生化試驗。

1.2.3 細菌的16S rRNA的測定 提取細菌的基因組，將菌液反復吸取混勻后，吸取200 μL 12 000 r/min離心1 min，棄去上清，保留沉淀。加入去離子水200 μL，沖洗，12 000 r/min離心1 min，棄去上清，保留沉淀，重復1次。加入1 mL溶菌酶，反復吹洗，搖床1 h，30 min，離心留沉淀，根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒上的步驟提取基因組。

PCR擴增：PCR擴增體系總體積20 μL，ddH2O 12.8 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mix 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物2F 1 μL，下游引物1492 R 1 μL，模板1 μL。PCR反應進行條件，94 ℃ 5 min；94℃ 40 s,56℃ 50 s,72℃ 90 s，共25個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.4 種屬引物測定 細菌基因組的提取步驟同1.2.3。PCR擴增：PCR反應體系總體積為20 μL，ddH2O 11.8 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板2 μL。PCR反應條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，49 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。產(chǎn)物經(jīng)鑒定后根據(jù)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒上的說明書進行回收，回收產(chǎn)物送由吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.2.5 藥敏試驗 藥物試驗采用KB法，選取20種常用的抗菌藥物進行試驗，以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株，試驗操作及判定標準按2009年美國NCCLS法規(guī)標準進行判定。將分離純化的菌株，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h～12 h后。用移液槍取200 μL菌液均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板上，自然干燥后，將頭孢噻呋鈉、萬古霉素、氯霉素，慶大霉素、氨芐西林，環(huán)丙沙星等20種藥敏片平貼于培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱放置24 h，判定結果，以抑菌圈直徑作為判定指標。

1.2.6 毒力基因鑒定 對屎腸球菌的主要毒力基因gel、esp、asa、cyt、ace、hyl，進行PCR鑒定。PCR反應體系：總體積為20 μL，ddH2O 11.8 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL。PCR反應條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min,49 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.7 致病性試驗 將分離純化的菌株于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng)，腹腔注射5只健康小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射0.5 mL，攻毒劑量為5×108CFU，對照組2只小鼠腹腔注射LB液體培養(yǎng)基，隔離飼養(yǎng)，觀察記錄小鼠發(fā)病及死亡情況。對未死亡小鼠5 d后剖檢，從肝臟中再次分離細菌。

2 結果

2.1 細菌分離與生化鑒定結果

將病料接種到LB平板培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，可見大量蔓延生長的不溶血、不透明的小菌落；接種到麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，其生長情況為黃灰色光滑干燥小菌落。取少量菌體接種于液體LB中培養(yǎng)12 h～24 h，之后接種于血平板中，觀察溶血性，可見菌體不溶血。三糖鐵斜面培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察其生化反應，結果為不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)H2S。菌體呈現(xiàn)橢圓形或圓形，革蘭氏染色陽性。

2.2 16S rRNA鑒定結果

2.2.1 16S rRNA擴增鑒定結果 凝膠塊的第一個孔加入DNA標準DL 2 000，分離株16S rRNA基因PCR結果是核酸電泳鑒定分離菌株在1 500 bp擴增出條帶。

2.2.2 16S rRNA序列鑒定結果 根據(jù)Blast序列比對，可以看出序列一致性為99%(圖1)。

2.3 種屬引物鑒定結果

該分離菌經(jīng)PCR擴增出了一條112 bp的條帶(圖2)。這與屎腸球菌片段大小相一致，結合2.2中的結果，序列同源性為99%，說明該分離菌為屎腸球菌。

2.4 藥敏試驗結果

采用KB擴散法檢測藥物敏感性，結果如表1所示，檢測的20種抗菌藥物中，分離菌株11001對氯霉素和萬古霉素表現(xiàn)敏感，對β-內(nèi)酰胺類、林可酰胺類、四環(huán)素類、頭孢第三代抗生素、氨基糖苷類抗生素、喹諾酮類、多肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、及呋喃類抗菌藥表現(xiàn)耐藥。

圖1 分離株16S rRNA序列Blast結果

M.DNA 標準DL 2 000;1.tuf;2.陰性對照

表1 分離菌的藥敏試驗結果

2.5 毒力基因檢測結果

提取分離菌的DNA，對分離菌11001進行屎腸球菌毒力基因gel、hyl、esp、cyt、asa、ace的PCR鑒定，依次擴增出213、276、510、475、375、320 bp片段,與預期條帶的長度一致，說明分離菌11001攜帶屎腸球菌的毒力基因。部分毒力基因PCR結果如圖3所示。

M.DNA 標準DL 2 000;1.esp;2.asa;3.ace;4.hyl

2.6 致病性試驗結果

試驗組的5只小鼠，12 h后5只小鼠出現(xiàn)急性死亡，死亡體態(tài)呈現(xiàn)四肢蜷縮狀。對照組2只小鼠無明顯臨床癥狀。剖檢所見，試驗組5只小鼠脾臟均有淤血，大腸均充滿大量氣體，其他臟器未見明顯異常。

3 討論

目前，有關腸球菌感染的報道日漸增多。1899年最早報道腸球菌感染與人的感染性心內(nèi)膜炎有關[6]，之后的報道顯示腸球菌引起一系列醫(yī)院內(nèi)感染，包括新生兒敗血癥、盆腔感染及尿路感染等[7]。動物感染屎腸球菌表現(xiàn)各異，豬感染后多在1 d～3 d內(nèi)死亡，特征性表現(xiàn)結膜充血、分泌物增多，全身瘀斑及口鼻出血[8]；雛雞感染屎腸球菌主要表現(xiàn)肝臟腫大、出血等[9]。動物感染屎腸球菌的病例越來越多，狐貍感染的病例報道較少，應引起足夠的重視。

本試驗從死亡狐貍的肺臟分離到細菌，為革蘭氏染色陽性，菌體呈現(xiàn)圓形或橢圓形，不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)H2S，滴加30 mL/L H2O2無氣泡產(chǎn)生，這與之前的報道中屎腸球菌的形態(tài)及生化特征相一致[3]。對分離株進行16S rRNA鑒定以及種屬引物PCR擴增，結果顯示分離株為屎腸球菌，且擴增結果與之相一致。藥敏試驗結果顯示，該分離株在被檢的20種抗菌藥物中，僅對氯霉素和萬古霉素表現(xiàn)為敏感，對其他抗菌藥物均表現(xiàn)耐藥，這可能是由于狐貍場在預防及治療疾病方面的用藥習慣導致的。對屎腸球菌毒力基因gel、hyl、esp、cyt、asa、ace的PCR鑒定，依次擴增出213、276、510、475、375、320 bp片段，與預期條帶長度一致，說明分離菌11001可能攜帶屎腸球菌的毒力基因。Hy1基因主要出現(xiàn)于臨床感染的屎腸球菌中，在屎腸球菌致病中起著重要的作用，可能是屎腸球菌的毒力基因之一[10]。分離株在致病性試驗中試驗組5只小鼠全部死亡，說明該株屎腸球菌有一定的致病性。

屎腸球菌通常存在于環(huán)境和機體腸道內(nèi)，屬于條件性致病菌，正常時不易發(fā)病[7]，抗菌藥物及其他抗菌藥物的不合理使用導致屎腸球菌的大量增殖，從而產(chǎn)生致病性[11]。所以應注意公共衛(wèi)生，提高和加強飼養(yǎng)環(huán)境建設，減少疾病的發(fā)生。本試驗從患病狐貍肺臟著手，分離到屎腸球菌，這在之前狐貍體內(nèi)病原菌的研究中鮮少報道，其分離鑒定及病原分析結果能為狐貍屎腸球菌感染的研究提供相關數(shù)據(jù)。但由于時間和試驗條件等因素的限制，沒有進行厭氧菌、支原體、螺旋體、寄生蟲等的培養(yǎng)分離，但不排除有這些病原的并發(fā)或繼發(fā)感染。今后將繼續(xù)深入研究狐貍感染屎腸球菌的發(fā)病原因及預防措施，為狐貍養(yǎng)殖業(yè)屎腸球菌感染的防控提供理論支持。