李 睿，喬松林，張改平

(河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗稱豬藍耳病，臨床癥狀為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬呼吸道疾病等[1]。PRRS病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒[2]，危害巨大，多年來一直是獸醫(yī)和病毒學領(lǐng)域的重點研究對象。然而，由于PRRSV具有獨特而且復雜的感染機制，目前對其防控并未取得顯著效果[3]。作為具有囊膜的病毒，PRRSV感染宿主細胞需進行病毒囊膜與宿主細胞靶膜融合(membrane fusion)這一關(guān)鍵步驟。因此，追蹤PRRSV膜融合最新研究進展將為深入理解PRRSV致病機制奠定基礎(chǔ)，并為防控PRRS提供新的思路和策略。

1 囊膜病毒及其膜融合機制

囊膜病毒(enveloped viruses)是一類在由核酸(DNA或RNA)和蛋白質(zhì)外殼(capsid)組成的核衣殼(nucleocapsid)外具有脂質(zhì)雙分子層囊膜結(jié)構(gòu)(envelope)的病毒[4]。因缺乏復制必需的基本系統(tǒng)，病毒自身不能增殖，必須感染宿主細胞，將核酸侵入宿主細胞內(nèi)借助宿主細胞的復制系統(tǒng)增殖新的病毒從而進行傳播[5]。囊膜病毒感染宿主細胞的關(guān)鍵步驟是病毒囊膜與宿主細胞膜(plasma membrane)或胞內(nèi)體(endosomes)膜等靶膜的融合[6]。這一過程是由病毒膜融合蛋白(fusion protein)介導，宿主細胞受體結(jié)合、低pH刺激、蛋白酶切割等誘導和激發(fā)的復雜過程[7]。根據(jù)囊膜病毒膜融合蛋白在囊膜表面的結(jié)構(gòu)、排列及膜融合時構(gòu)象變化等的不同，目前可將囊膜病毒膜融合蛋白分為3類，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型[8]。Ⅰ型膜融合蛋白，以副流感病毒(Parainfluenza virus)為例，富含α-螺旋結(jié)構(gòu)(α-helix)，在電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的“纖突”或“刺突”，具有融合肽(fusion peptide)，膜融合完成后變構(gòu)形成穩(wěn)定折疊的三聚體發(fā)夾結(jié)構(gòu)(trimer-of-hairpins)；Ⅱ型膜融合蛋白，以蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)為例，富含β-片層結(jié)構(gòu)(β-sheet)卻不形成“纖突”或“刺突”，具有融合環(huán)(fusion loop)，但最終膜融合完成后仍會形成三聚體發(fā)夾結(jié)構(gòu)；Ⅲ型膜融合蛋白，以水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)為例，兼具α-螺旋和β-片層結(jié)構(gòu)，目前這類病毒膜融蛋白研究還不全面[9]。

研究囊膜病毒膜融合機制具有重要的科學意義和應用價值，針對病毒膜融合蛋白可制備高效特異性疫苗或針對病毒膜融合過程研發(fā)新型抗體類和小分子類抗病毒藥物等[10-11]。例如，根據(jù)人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)膜融合蛋白設(shè)計的多肽類抑制藥物恩夫韋肽(enfuvirtide)已獲得美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準應用于臨床治療并取得了顯著的抑制病毒感染效果[12]。近期，復旦大學陸路/姜世勃等發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)膜融合抑制劑針對新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)治療具有較好的臨床應用前景[13]。

2 PRRSV與膜融合

PRRS于20世紀80年代末90年代初分別在美洲和歐洲報道[14]。自此該病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，目前已成為威脅全球養(yǎng)豬業(yè)最主要的傳染病之一，造成了巨大的經(jīng)濟損失[15]。據(jù)估計PRRS每年給美國養(yǎng)豬業(yè)造成近6.5億美元的經(jīng)濟損失[15]。自1995年我國首次報道PRRS以來，該病在國內(nèi)長期流行[16]?？紤]到國內(nèi)養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖水平，PRRS對我國養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟損失應遠大于美國。特別是2006年，我國大面積暴發(fā)和流行的以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的高致病性PRRS(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，對國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了前所未有的打擊[17-18]。從2013年起，由NADC30樣(NADC30-like)毒株引起的PRRS在國內(nèi)出現(xiàn)并廣泛流行，引發(fā)了新的關(guān)注[19-21]。

PRRSV屬于套式病毒目(Nidovirales)動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Porartevirus)[22-23]。PRRSV分離毒株分為2個基因型，即PRRSV-1和PRRSV-2[24]。PRRSV基因組約15 kb，含有至少10個開放閱讀框(open reading frames，ORFs)[22]。其中，ORF1(ORF1a和ORF1ab)編碼RNA依賴的RNA聚合酶等非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural proteins，Nsps)；ORF5-7分別編碼囊膜糖蛋白(glycoprotein，GP)GP5、基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)，它們是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5a分別編碼囊膜糖蛋白GP2a、GP2b(又稱E)、GP3、GP4 和GP5a，它們是PRRSV的次要結(jié)構(gòu)蛋白[25]。GP5、M、GP2a、GP2b、GP3、GP4 和GP5a分布在PRRSV囊膜表面[26]。

豬是PRRSV目前唯一已知的宿主，PRRSV在豬體內(nèi)主要感染單核/巨噬細胞，如豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)[27]。PRRSV在體外還感染非洲綠猴腎上皮細胞系MA-104及其衍生的MARC-145細胞系等[28]。研究證實PRRSV是由宿主細胞表面必需受體CD163介導，通過網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑(clathrin-mediated endocytosis，CME)入侵宿主細胞的[29-33]。作為一種具有囊膜的病毒，PRRSV感染宿主細胞需進行膜融合這一關(guān)鍵步驟。但是，目前國內(nèi)外在PRRSV膜融合機制研究領(lǐng)域存在很多空白，包括病毒必需受體CD163在PRRSV 膜融合過程中的具體作用機理，除必需受體CD163外是否還存在其他宿主因子(如低pH、蛋白酶)甚至是輔助受體參與PRRSV膜融合及其作用細節(jié)，在PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中參與膜融合的囊膜蛋白是哪個(些)及其參與膜融合詳細機制等。這些問題嚴重阻礙了人們對PRRSV致病機理的全面認識及對PRRS的有效防控。

3 PRRSV膜融合機制最新研究進展

近年來，隨著研究深入，國內(nèi)學者率先在PRRSV膜融合領(lǐng)域取得進展。

2019年中國農(nóng)業(yè)大學楊漢春教授、韓軍教授研究團隊利用親脂性染料R18標記HP-PRRSV毒株JXwn06及其缺失突變株，通過激光共聚焦顯微術(shù)(laser confocal microscopy，LCM)發(fā)現(xiàn)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2高變區(qū)(hypervariable region)323-521位氨基酸缺失影響了PRRSV膜融合，揭示了該蛋白在PRRSV感染中的新功能[34]。

本研究團隊近期利用病毒囊膜親脂性染料DiD標記PRRSV-2經(jīng)典毒株BJ-4通過LCM監(jiān)測到PRRSV在感染MARC-145細胞和PAMs早期(45 min)發(fā)生膜融合；然后利用亞細胞定位標志物證實PRRSV在以Ras相關(guān)蛋白11(Ras-related protein 11，Rab11)為標志的循環(huán)胞內(nèi)體(recycling endosomes)發(fā)生膜融合；進一步通過顯性失活/組成型激活(dominant negative/constitutive active，DN/CA)突變體、特異性抑制劑(inhibitors)、RNA干擾(RNA interferece，RNAi)等驗證Rab11-recycling endosomes中低pH和組織蛋白酶E(cathepsin E)在PRRSV膜融合過程中發(fā)揮重要作用；通過實時定量PCR試驗(real-time PCR，PCR)測定PRRSV ORF7復制、蛋白印跡法(Western blot，WB)測定PRRSV N蛋白翻譯、病毒滴度試驗(50% tissue culture infectious dose，TCID50)測定PRRSV子代病毒等證實阻礙PRRSV膜融合過程會影響病毒感染；最后經(jīng)病毒蛋白特異性抗體檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV膜融合過程中其囊膜糖蛋白GP5被cathepsin E切割[35]。這一研究在國內(nèi)外首次揭示了PRRSV膜融合細節(jié)，加深了人們對PRRSV致病機制的理解；更重要的是，該研究鑒定出的低pH、cathepsin E、GP5可作為抗PRRSV藥物和疫苗的新靶標。

4 結(jié)語

綜上所述，雖然近年來國內(nèi)學者在PRRSV膜融合機制取得了研究進展，但是PRRSV膜融合領(lǐng)域仍存在許多空白值得深入研究：病毒必需受體CD163在PRRSV膜融合過程中的具體作用機制;除Rab11、低pH、cathepsin E外是否還存在其他宿主因子參與PRRSV膜融合及其作用機理;PRRSV GP5蛋白是否作為病毒膜融合蛋白等。基于已取得的進展，持續(xù)深入研究PRRSV膜融合機制將為防控該病毒提供新的思路和策略，具有重要的科學意義和應用前景。