黃運(yùn)福，貢莎莎，孟慶玲*，喬 軍 ，張國(guó)武，王熙鳳，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003； 2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

捕食線蟲性真菌(nematode-trapping fungi)是一類通過(guò)產(chǎn)生復(fù)雜的捕食結(jié)構(gòu)來(lái)捕獲和殺死線蟲的絲狀真菌，也是自然界中線蟲重要的天敵和生防資源[1]。少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)是捕食線蟲性真菌中極具應(yīng)用潛力的代表菌，是研究最多、應(yīng)用最廣的生防真菌之一[2]。目前，對(duì)少孢節(jié)叢孢菌的分子背景研究較為清楚，其全基因組的測(cè)序成功[3]為在分子水平研究少孢節(jié)叢孢菌以及菌株改造奠定了基礎(chǔ)。

遺傳轉(zhuǎn)化是進(jìn)行新基因功能研究和菌種改良的重要手段。絲狀真菌轉(zhuǎn)化方法有CaCl2-PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法、限制酶介導(dǎo)整合法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、基因槍法等，但這些轉(zhuǎn)化方法或涉及原生質(zhì)體的制備和再生，或花費(fèi)高昂、應(yīng)用范圍窄，或轉(zhuǎn)化效率低、遺傳不穩(wěn)定等，這些不足限制了它們?cè)谡婢芯恐械膽?yīng)用[4]。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)利用農(nóng)桿菌將供體質(zhì)粒中轉(zhuǎn)移的DNA(T-DNA)插入到宿主基因組中，具有操作簡(jiǎn)單、受體廣泛、單拷貝插入、轉(zhuǎn)化效率高和遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此成為絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的有效方法[5]。ATMT技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于黃曲霉菌[6]、指狀青霉菌[7]、雙孢蘑菇[8]等多種絲狀真菌的轉(zhuǎn)化。目前，少孢節(jié)叢孢菌成熟的遺傳轉(zhuǎn)化方法為以原生質(zhì)體為受體的CaCl2-PEG介導(dǎo)法[9]和限制酶介導(dǎo)整合法[10-11]，但以原生質(zhì)體為受體的轉(zhuǎn)化本身具有的缺點(diǎn)限制了它的應(yīng)用，因此探索并建立一套高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)于少孢節(jié)叢孢菌的分子生物學(xué)研究具有重要意義。本研究擬利用ATMT技術(shù)轉(zhuǎn)化少孢節(jié)叢孢菌并優(yōu)化其轉(zhuǎn)化體系，為少孢節(jié)叢孢菌功能新基因的研究及菌株改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1、EscherichiacoliDH5α菌株、根癌農(nóng)桿菌AGL-1、EHA105和GV3101菌株、pAN7-1質(zhì)粒、pCAMBIA1304質(zhì)粒、pMD19-PtrpC質(zhì)粒，石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(以下簡(jiǎn)稱本實(shí)驗(yàn)室)保存；真菌表達(dá)載體pCAMBIA1304'-PgpdA，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、pMD19-T(simple)、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Mix，廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品； DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 600、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；GUS染色試劑，北京華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品；利福平、頭孢霉素、卡那霉素、乙酰丁香酮，Sigma公司產(chǎn)品；潮霉素，Roche公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)、誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)及共培養(yǎng)基(CM)按照常規(guī)方法制備。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫?fù)u床(ZHWY-2102C)，PCR儀(TC4000)，真菌培養(yǎng)箱(MJX280)，恒溫培養(yǎng)箱(HIQ-X100)，振蕩培養(yǎng)箱(ZHWY-2102C)，常規(guī)離心機(jī)(Beckmanmicrofuge16)，瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN)，凝膠成像儀(Bio-Rad)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo，MuLtiskanGO)，生物顯微鏡(CX21BIM)。

1.2 方法

1.2.1 少孢節(jié)叢孢菌對(duì)潮霉素選擇壓敏感性測(cè)定 將少孢節(jié)叢孢菌接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)14 d后收集分生孢子，吸取10 μL孢子懸浮液滴于含有0、50、100、150、200 mg/L潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察真菌生長(zhǎng)情況。

1.2.2 真菌表達(dá)載體的構(gòu)建 通過(guò)融合PCR獲得PtrpC-hph片段。以pMD19-PtrpC質(zhì)粒為模板，克隆363 bp的PtrpC啟動(dòng)子序列(引物：PtrpCF:5'-CGAGCTCTACGTACAGAAGATGATATTG-3' ; PtrpCR: 5'-CGCGGTGAGTTCAGGCATATGCTTGGGTAGAATAGG-3'，上游引物引入SacⅠ酶切位點(diǎn))。以質(zhì)粒pAN7-1為模板，克隆1 020 bp的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hph序列(引物：hphF:5'-CCTATTCTACCCAAGCATATGCCTGAACTCA

CCGCG-3';hphR:5'-CCTCGAGCTATTCCTTTGCCCTCGG-3'，下游引物引入XhoⅠ酶切位點(diǎn))。再以PtrpC和hph片段為模板，用引物PtrpCF和hphR進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PtrpC-hph片段，克隆至pMD19-T載體。對(duì)測(cè)序正確的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切得到PtrpC-hph片段，與同樣用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA1304得到的大片段連接，構(gòu)建出真菌表達(dá)載體pCAMBIA1304'。

以質(zhì)粒pAN7-1為模板，克隆2 129 bp的PgpdA啟動(dòng)子序列(引物：PgpdAF:5'-GCTCTAGAGAATTCCCTTGTATCTCTACAC-3';PgpdAR:5'-CATGCCATGGGAAAAGAAAGAGAAAAG-3'，上游引物引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入NcoⅠ酶切位點(diǎn))，克隆至pMD19-T載體。對(duì)測(cè)序正確的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和NcoⅠ進(jìn)行雙酶切得到PgpdA啟動(dòng)子片段，與同樣用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和NcoⅠ雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA1304'得到的大片段連接，構(gòu)建出真菌表達(dá)載體pCAMBIA1304'-PgpdA，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ、XbaⅠ和NcoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

表達(dá)載體pCAMBIA1304'-PgpdA通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，對(duì)在含有100 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單克隆菌株通過(guò)PCR擴(kuò)增hph基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的少孢節(jié)叢孢菌遺傳轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的少孢節(jié)叢孢菌遺傳轉(zhuǎn)化體系為：以農(nóng)桿菌AGL-1、EHA105和GV3101為浸染菌株，轉(zhuǎn)化受體為少孢節(jié)叢孢菌分生孢子，少孢節(jié)叢孢菌孢子懸浮液濃度為1×106個(gè)/mL和1×108個(gè)/mL，乙酰丁香酮濃度為200 μmol/L，共培養(yǎng)溫度為23 ℃和26 ℃，共培養(yǎng)時(shí)間為48 h和60 h。按以下步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化：將含有表達(dá)載體pCAMBIA1304'-PgpdA的農(nóng)桿菌置于10 mL含有50 mg/L利福平和100 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，收集菌體后用3 mL IM培養(yǎng)基重懸至濃度為OD 600 nm為0.15～0.2，繼續(xù)培養(yǎng)至OD 600 nm為0.5～1.0。取100 μL經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌液與少孢節(jié)叢孢菌孢子懸浮液等體積混合，涂布于CM培養(yǎng)基表面的微孔濾膜，置于避光環(huán)境進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.2.4 重組少孢節(jié)叢孢菌的篩選 將共培養(yǎng)基表面的微孔濾膜倒貼到含有400 mg/L頭孢霉素和150 mg/L潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后用無(wú)菌鑷子輕輕揭掉微孔濾膜，繼續(xù)培養(yǎng)7 d～9 d。將長(zhǎng)勢(shì)良好的少孢節(jié)叢孢菌轉(zhuǎn)接到新的含有400 mg/L頭孢霉素和150 mg/L潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.5 重組少孢節(jié)叢孢菌的鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析 按照杭州博日科技有限公司Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取在含潮霉素抗性的PDA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的少孢節(jié)叢孢菌的基因組DNA，擴(kuò)增hph和gus基因進(jìn)行驗(yàn)證。將PCR檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，從邊緣挑取菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)，再次將少孢節(jié)叢孢菌轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入含150 mg/L潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，提取正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子基因組DNA，PCR擴(kuò)增hph和gus基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 重組少孢節(jié)叢孢菌GUS活性分析 將轉(zhuǎn)化子及出發(fā)菌株分別接至PDA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d后切取菌塊進(jìn)行GUS染色，將菌塊置于Ep管中，加入一定量的GUS染液將菌塊完全浸泡，于37 ℃閉光24 h，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 少孢節(jié)叢孢菌對(duì)潮霉素選擇壓力敏感性測(cè)定

對(duì)不同濃度潮霉素抗性PDA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的少孢節(jié)叢孢菌生長(zhǎng)情況觀察，少孢節(jié)叢孢菌在潮霉素濃度為150 mg/L時(shí)完全停止生長(zhǎng)，因此選擇150 mg/L作為篩選濃度(圖1)。

2.2 真菌表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

通過(guò)融合PCR擴(kuò)增得到PtrpC-hph片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，PtrpC啟動(dòng)子序列約為363 bp(圖2A)，PtrpC-hph片段約為1 383 bp(圖2B)，hph基因約為1 020 bp(圖2C)，PgpdA啟動(dòng)子序列約為2 129 bp(圖2D)。將PtrpC-hph片段和PgpdA啟動(dòng)子片段先后插入pCAMBIA1304質(zhì)粒得到真菌表達(dá)載體pCAMBIA1304'-PgpdA，表達(dá)載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ、XbaⅠ和NcoⅠ雙酶切鑒定可得到大小約1 383 bp(圖3A)和2 129 bp(圖3B)的條帶，證實(shí)成功構(gòu)建了真菌表達(dá)載體。

2.3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將構(gòu)建的表達(dá)載體 pCAMBIA1304'-PgpdA通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL-1、EHA105和GV3101后，各挑取2顆單菌落通過(guò)PCR擴(kuò)增hph基因，證實(shí)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中(圖4)。

A～E.0、50、100、150、200 mg/L

A.PtrpC;B.PtrpC-hph;C.hph;D.PgpdA;M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 600;M2.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;M3.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;4.陰性對(duì)照

M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;M2.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000;1.雙酶切對(duì)照;2.重組質(zhì)粒雙酶切(SacⅠ和Xho Ⅰ);3.雙酶切對(duì)照;4.重組質(zhì)粒雙酶切(XbaⅠ和Nco Ⅰ)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～2.GV3101;3～4.EHA105;5～6.AGL-1;7.陰性對(duì)照

2.4 重組少孢節(jié)叢孢菌的篩選與分子鑒定

揭掉微孔濾膜培養(yǎng)4 d后，發(fā)現(xiàn)含頭孢霉素和潮霉素抗性的PDA固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出許多密集成片的真菌，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)天，結(jié)果農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在1×106個(gè)/mL孢子懸浮液，共培養(yǎng)階段為23 ℃培養(yǎng)60 h的條件下有1株轉(zhuǎn)化子能正常生長(zhǎng)，將其轉(zhuǎn)接至含150 mg/L潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，其長(zhǎng)勢(shì)良好(圖5A)。提取該菌株基因組DNA進(jìn)行hph和gus基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果能擴(kuò)增出hph和gus基因片段(圖5B)。

2.5 重組少孢節(jié)叢孢菌的遺傳穩(wěn)定性分析

少孢節(jié)叢孢菌轉(zhuǎn)化子在無(wú)潮霉素選擇壓力的PDA固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)5代次后，再次轉(zhuǎn)入含有150 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA進(jìn)行hph和gus基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果從轉(zhuǎn)化子可以擴(kuò)增出hph和gus基因的目的條帶，表明hph和gus基因在重組少孢節(jié)叢孢菌中可以穩(wěn)定遺傳(圖6)。

A.菌落；B.PCR;a.出發(fā)菌株;b-c.假陽(yáng)性菌株;d.陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.hph基因;2.gus基因;3.陰性對(duì)照

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.hph基因;2.gus基因;3.陰性對(duì)照

2.6 重組少孢節(jié)叢孢菌gus基因活性分析

分別將轉(zhuǎn)化子和對(duì)照菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d后進(jìn)行GUS染色。如圖7所示，出發(fā)菌株并未染色(圖7A)，轉(zhuǎn)化子有明顯藍(lán)色(圖7B)，表明gus基因被整合到少孢節(jié)叢孢菌基因組中并在PgpdA啟動(dòng)子調(diào)控下正常表達(dá)。

3 討論

Gus基因在許多真菌、細(xì)菌等微生物中很少或完全檢測(cè)不到活性，因此也應(yīng)用于如棉花黃萎病菌[12]、萊氏野村菌[13]和金針菇[14]等多種真菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。Tunlid A等[10]通過(guò)限制酶介導(dǎo)整合法將攜帶gus基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化少孢節(jié)叢孢菌，在16株轉(zhuǎn)化子中有10株檢測(cè)到GUS活性，說(shuō)明gus基因能做為少孢節(jié)叢孢菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的報(bào)告基因。

A.出發(fā)菌株;B.轉(zhuǎn)化子

ATMT是一種高效轉(zhuǎn)化絲狀真菌的有力工具，其介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程基本相同，但轉(zhuǎn)化效率取決于真菌受體、農(nóng)桿菌菌株類型、乙酰丁香酮的濃度、農(nóng)桿菌和真菌受體的比例以及共培養(yǎng)溫度和時(shí)間[15]；此外，還受到孢子濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、pH等因素的影響。通過(guò)優(yōu)化這些影響條件，很多真菌實(shí)現(xiàn)了更高的轉(zhuǎn)化率[16]。ATMT介導(dǎo)的少孢節(jié)叢孢菌轉(zhuǎn)化甚少報(bào)道，劉瑞[17]利用 ATMT技術(shù)在以孢子懸浮液、菌塊懸浮液、菌絲溶液和原生質(zhì)體溶液為受體，農(nóng)桿菌AGL-1為浸染菌株，孢子濃度為1×105個(gè)/mL，共培養(yǎng)條件為22 ℃培養(yǎng)48 h的轉(zhuǎn)化體系對(duì)少孢節(jié)叢孢菌云南株YMF1.1883進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果獲得了3株轉(zhuǎn)化子。在本研究中，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)，農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在1×106個(gè)/mL孢子懸浮液，共培養(yǎng)階段為23 ℃培養(yǎng)60 h的條件下獲得了1株轉(zhuǎn)化子。盡管優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系不盡相同，但轉(zhuǎn)化率基本相同，與利用限制酶介導(dǎo)整合法轉(zhuǎn)化少孢節(jié)叢孢菌獲得35個(gè)/μg DNA[11]的最大轉(zhuǎn)化率相比，ATMT介導(dǎo)的少孢節(jié)叢孢菌遺傳轉(zhuǎn)化可能更難以實(shí)現(xiàn)，這可能是由影響ATMT轉(zhuǎn)化效率的多種因素造成的，也可能是少孢節(jié)叢孢菌不適合采用ATMT進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這有待于進(jìn)一步研究。

本研究利用ATMT對(duì)少孢節(jié)叢孢菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，證實(shí)ATMT可以應(yīng)用于少孢節(jié)叢孢菌的轉(zhuǎn)化，為少孢節(jié)叢孢菌的生防機(jī)制、遺傳轉(zhuǎn)化及菌株改良等研究奠定了基礎(chǔ)。