林楚云，劉建奎，林志鋒，林日丹，楊小燕*，戴愛玲*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364000；3.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的重要病毒性傳染病[1]。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15 kb，至少包含10個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)，其中ORF1中的Nsp2、ORF3、ORF5a和ORF5等基因高度變異，而ORF5基因的變異情況在很大程度上可以反映PRRSV基因組的遺傳變異特征。PRRSV分為歐洲型和美洲型2種基因型，我國(guó)的流行毒株以美洲型毒株為主。PRRSV基因組存在高度的變異，先后出現(xiàn)經(jīng)典毒株、高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株及類NADC30毒株[2]，給該病的防控帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。

2019年11月，福建省某PRRS疫苗非免疫存欄能繁母豬700頭的原種豬場(chǎng)，母豬先后出現(xiàn)早產(chǎn)、產(chǎn)弱仔，保育豬出現(xiàn)扎堆、嗜睡、喘氣、體溫升高、采食量下降等臨床癥狀，病死率近10%。臨床剖檢3頭保育豬，肺部可見間質(zhì)性肺炎，全身淋巴結(jié)輕度水腫，其中1頭出現(xiàn)心包炎病變。通過3頭保育豬的臨床特征和病理剖檢，初步診斷為PRRSV感染，為進(jìn)一步確診并了解PRRSV毒株流行情況，采集2周齡～8周齡的臨床疑似發(fā)病的保育豬全血，4 ℃保存，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PRRSV RT-PCR檢測(cè)及ORF5基因序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源 樣品采集于存欄700頭的福建某原種豬場(chǎng)，采集2周齡～8周齡各周齡段臨床疑似發(fā)病保育豬全血各5份，將相同周齡的5份全血各取50 μL，合為1份，并命名為2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒，北京天根生化有限公司產(chǎn)品；Random Primer、Oligo (dt)18 Primer、Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)、TaKaRaTaq聚合酶(5 U/μL)、Recombinase RNase Inhibitor(40 U/μL)、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000 、dNTP,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 按照參考文獻(xiàn)[3]的方法設(shè)計(jì)PRRSV ORF5基因特異性引物，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增目的片段大小約為700 bp。

1.1.4 儀器設(shè)備 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(CL31R)、二氧化碳培養(yǎng)箱(3111)，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；PCR儀(MycycLerTM)、凝膠成像系統(tǒng)(GeL Doc TMXR)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1D)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-2C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料核酸的提取 取2周齡～8周齡保育豬全血，進(jìn)行RNA提取，方法參照北京天根生化有限公司總RNA提取試劑盒說(shuō)明書。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè) RT-PCR反應(yīng)如下：取16 μL的RNA，分別加入1 μL Random Primer、1 μL Oligo (dt)18 Primer，以18 μL體系用PCR儀進(jìn)行70 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min；反應(yīng)結(jié)束后直接加入4 μL 5× M-MLV buffer、2 μL dNTP、1 μL RTase M-MLV、1 μL Recombinase RNase Inhibitor，以26 μL體系用PCR儀進(jìn)行30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，4 ℃ 10 min，所得產(chǎn)物即為cDNA。取2 μL 模板cDNA，加入ORF5上、下游引物各1 μL，2.5 μL 10× PCR buffer，2 μL dNTP，0.2 μLTaq，16.3 μL ddH2O；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。同時(shí)設(shè)不加模板的陰性對(duì)照。取10 μLPCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并以DNA標(biāo)準(zhǔn)DL1 000為對(duì)照，觀察目的條帶和判斷結(jié)果。

1.2.3 序列測(cè)定及分析 將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNA Star軟件對(duì)ORF5基因序列與GenBank中收錄的PRRSV ORF5基因序列的核苷酸進(jìn)行同源性分析，并應(yīng)用Mega6.0軟件繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2周齡～8周齡保育豬全血經(jīng)RT-PCR后凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示，5W、6W、7W、8W保育豬全血均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶約700 bp，而2W、3W、4W保育豬全血均未擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖1)，表明該豬場(chǎng)5周齡～8周齡保育豬存在PRRSV感染。

2.2 核苷酸同源性分析

經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序并進(jìn)行Blast比對(duì)，所測(cè)得的序列為PRRSV ORF5基因特異性的序列。經(jīng)PRRSV ORF5基因核苷酸同源性分析，5W毒株ORF5基因與HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4和TJ同源性最高為95.4%～95.6%，與VR2332和疫苗毒株Resp PRRS MLV為經(jīng)典毒株代表毒株的同源性為87.4%，與譜系3代表毒株QYYZ、FJFS的同源性為82.3%～82.7%，與類NADC30 PRRSV代表毒株NADC30、FJZ03、FJY04和CHsx1401同源性為84.1%～84.6%；6W、7W、8W毒株的ORF5基因與類NADC30 PRRSV代表毒株NADC30、FJZ03、FJY04和CHsx1401同源性較高，分別為88.9%～91.1%、89.6%～91.9%和89.3%～91.6%，與VR2332和疫苗毒株RespPRRS MLV為經(jīng)典毒株代表毒株的同源性分別為83.5%、83.7%和83.7%，與譜系3代表毒株QYYZ和FJFS同源性分別為83.3%～84.2%、83.5%～84.2%和83.7%～84.4%，與HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4和TJ同源性分別為85.4%、85.6%和85.6%(圖2)。綜上所示，該豬場(chǎng)5W保育豬感染的是HP-PRRSV毒株，6W-8W保育豬感染的是類NADC30毒株。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.2W；2.3W；3.4W；4.5W；5.6W；6.7W；7.8W；8.陰性對(duì)照

2.3 核苷酸遺傳進(jìn)化樹

遺傳進(jìn)化樹表明，5W毒株與JXA1、HuN4和TJ的HP-PRRSV代表毒株處于同一分支，親緣關(guān)系較近，而與NADC30、VR2332、QYYZ、FJFS等代表毒株處于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；6W、7W、8W毒株與NADC30、FJZ03、CHsx1401等類NADC30 PRRSV代表毒株處于同一分支，親緣關(guān)系較近，而與JXA1、QYYZ、VR2332等代表毒株處于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。綜上結(jié)果表明，該豬場(chǎng)5W毒株為HP-PRRSV毒株；6W、7W、8W毒株均為類NADC30毒株。

圖2 PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性分析

圖3 PRRSV ORF5基因核苷酸的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

1987年，PRRS首次在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，之后迅速傳播至許多國(guó)家。1995年，中國(guó)首次分離出PRRSV CH-la毒株。2006年，中國(guó)南部部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)HP-PRRSV，其高致病性、高病死率給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。2001年末，美國(guó)發(fā)現(xiàn)PRRSV變異株，其特征是Nsp2存在131個(gè)不連續(xù)的氨基酸缺失，缺失模式為“111+1+19”。2008年，美國(guó)國(guó)家動(dòng)物疾病研究中心(NADC)首次命名NADC30毒株[4-5]。自2012年起，我國(guó)陸續(xù)分離到與NADC30同源關(guān)系較近的毒株(ORF5基因同源性 97%)，且具有特征性的“111+1+19”缺失模式，因此目前國(guó)內(nèi)將這類病毒統(tǒng)稱為類NADC30毒株[6]。ORF5基因編碼的囊膜蛋白GP5是PRRSV 基因組中高變區(qū)之一，是PRRSV主要的糖基化囊膜蛋白及重要保護(hù)性抗原，是變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白[7]。因此，ORF5基因常作為PRRSV分子流行病學(xué)調(diào)查及變異分析的研究切入點(diǎn)。

本文通過對(duì)PRRSV ORF5基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，5W保育豬全血中的PRRSV ORF5基因與HP-PRRSV代表毒株同源性最高；6W、7W、8W 保育豬全血中的PRRSV ORF5基因與類NADC30代表毒株同源性較高。結(jié)果表明，該豬場(chǎng)保育豬存在類NADC30和HP-PRRSV毒株混合感染。2019年，申歡歡等[8]報(bào)道了某規(guī)模化豬場(chǎng)存在類NADC30、HP-PRRSV和PRRSV毒株混合感染。中國(guó)是畜牧大國(guó)，復(fù)雜的飼養(yǎng)環(huán)境，頻繁的生豬運(yùn)輸和不當(dāng)?shù)囊N，使毒株變異頻發(fā)[9]，且類NADC30毒株與以往PRRSV毒株不同，該病毒與其他病毒重組率高，加重了豬場(chǎng)防疫的難度[10-11]。劉磊等[12]報(bào)道了2016年-2018年廣西地區(qū)14個(gè)地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)以HP-PRRSV毒株流行為主，但2018年出現(xiàn)了與美國(guó)NADC30處于同一分支的類NADC30毒株和與GM2處于同一分支的經(jīng)典株與變異株的重組毒株。袁為鋒等[13]報(bào)道了2016-2017年江西地區(qū)的美洲型毒株出現(xiàn)多基因亞型共存的局面，以HP-PRRSV為主，類NADC30毒株和新基因亞型等新毒株的比例較高。本課題組劉建奎等[9]報(bào)道了2013年福建省開始流行類NADC30毒株，并在2014年逐漸取代HP-PRRSV，成為優(yōu)勢(shì)毒株。外部環(huán)境中不同PRRSV毒株可通過多種途徑入侵豬場(chǎng)內(nèi)部，易增加豬場(chǎng)內(nèi)豬群野毒感染和毒株變異的風(fēng)險(xiǎn)。

據(jù)筆者調(diào)查，2018年10月引種前該豬場(chǎng)的PRRSV抗體監(jiān)測(cè)記錄，母豬PRRSV抗體陽(yáng)性率在40%～50%，豬場(chǎng)處于PRRSV陽(yáng)性穩(wěn)定狀態(tài)。引種后備豬有采取隔離措施，但混群后豬群還是出現(xiàn)了不穩(wěn)定狀態(tài)，2019年7月監(jiān)測(cè)母豬PRRSV抗體陽(yáng)性率100%。本次RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示該豬場(chǎng)5周齡～8周齡保育豬全血檢出PRRSV，存在PRRSV病毒血癥，臨床上暴發(fā)比較典型的PRRS癥狀。據(jù)郭林等[14]跟蹤與監(jiān)測(cè)PRRSV抗體消長(zhǎng)規(guī)律的結(jié)果，在未免疫任何PRRSV疫苗的豬場(chǎng)，PRRSV母源抗體在斷奶后2周(40日齡左右)降到最低。因此，斷奶后的保育豬因?yàn)槟冈纯贵w消失、自身的免疫系統(tǒng)還沒有完善、生長(zhǎng)速度加快、場(chǎng)內(nèi)外PRRSV毒株情況復(fù)雜、斷奶及轉(zhuǎn)欄應(yīng)激等多種因素使這個(gè)階段的豬易暴發(fā)PRRS。該豬場(chǎng)由于受非洲豬瘟疫情的影響，為了加強(qiáng)生物安全，減少豬群出欄次數(shù)，存在斷奶后保育豬存欄密度過大、氨氣濃度過高和冬季時(shí)沒有及時(shí)調(diào)整好豬舍環(huán)境等問題，進(jìn)而導(dǎo)致保育豬群PRRS的暴發(fā)，該場(chǎng)沒有采取緊急免疫PRRSV疫苗的措施，實(shí)行部分保育豬及中大豬的部分清群，淘汰沒有治療價(jià)值的發(fā)病豬，減少保育豬、中大豬的密度，同時(shí)添加藥物控制繼發(fā)感染和中藥類產(chǎn)品提高抵抗力等措施。曲向陽(yáng)[15]證明當(dāng)母豬群不穩(wěn)定時(shí)，感染仔豬免疫PRRSV弱毒疫苗會(huì)增加死淘率。因此，對(duì)于非免疫PRRSV疫苗豬場(chǎng)的豬藍(lán)耳病的防控，首先嚴(yán)把引種關(guān)，盡量在同一豬場(chǎng)引種，保障隔離時(shí)間，監(jiān)測(cè)隔離豬群的PRRSV毒株類型。在毒株型不同的情況下，盡量在抗原陰性時(shí)進(jìn)行本場(chǎng)毒株的馴化工作；其次，豬場(chǎng)要建立PRRSV監(jiān)測(cè)方案，降低豬場(chǎng)內(nèi)PRRSV的污染與病毒載量，阻斷病毒在豬群中間的循環(huán)與傳播；最后，改善豬場(chǎng)設(shè)備，如增加負(fù)壓空氣過濾系統(tǒng)，它可以有效的阻斷由空氣傳播所導(dǎo)致的PRRSV感染[16]。

PRRS作為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，目前主要防疫措施包括生物安全、免疫策略、感染狀態(tài)監(jiān)控等。不管哪種防控措施，毒株多樣化導(dǎo)致患病豬臨床表現(xiàn)多變和疫苗保護(hù)效力不佳，都給豬場(chǎng)的防控造成極大的困難。毒株馴化和封群管理是PRRS防控的重要方向，但國(guó)內(nèi)尚無(wú)利用該技術(shù)在區(qū)域化或大型養(yǎng)豬企業(yè)成功凈化PRRSV的報(bào)道。