王 雪，趙 靜，阮 征，肖 冉，黎 巧，裴 潔，李婷婷，萬(wàn) 云，岳 龍，張四化*

(1.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430014；2.湖北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430070)

豬口腔液是由豬口腔中的唾液和黏膜滲出液組成的混合液體[1-2]，含有唾液腺、呼吸道和齒齦溝的分泌物如血清衍生抗體、激素、細(xì)菌、病毒等[3]，是一種高效、方便的群體疫病監(jiān)測(cè)樣品。研究表明，豬口腔液含有感染機(jī)體的病原和抗體[4-5]，很多病毒在感染機(jī)體后的窗口期，已經(jīng)存在于豬的口腔分泌物中，可作為多種豬病的早期診斷樣品[6]，多項(xiàng)研究應(yīng)用常規(guī)PCR檢測(cè)口腔液中的病原核酸，如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)[7-8]、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)[9]、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)[10]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)[11]、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)[12]、豬偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)[13]、豬流感病毒(Swine influenza A virus，SIV)[14]、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)[15]等都可在豬口腔液中檢出。豬口腔液樣品采集較為簡(jiǎn)單，可通過(guò)吸附性材料如棉繩等收集，由于豬天生好奇和嗜咀嚼，會(huì)主動(dòng)接近并咬濕繩子，擠壓棉繩上的液體可獲得豬口腔液樣品[16-17]。相對(duì)于傳統(tǒng)的活體組織、血液等個(gè)體樣品，豬口腔液采集不需要保定動(dòng)物，對(duì)動(dòng)物無(wú)損傷、無(wú)應(yīng)激，符合動(dòng)物福利，對(duì)采樣人員的技術(shù)要求低，且一個(gè)樣品可覆蓋多頭豬、可連續(xù)重復(fù)采樣，能減少人力物力，有利于早期發(fā)現(xiàn)及診斷疫情[18]。目前大部分口腔液研究是基于檢測(cè)攻毒后的試驗(yàn)豬，應(yīng)用于實(shí)際豬場(chǎng)檢測(cè)病原的報(bào)道不多。為了解豬口腔液應(yīng)用于豬場(chǎng)病原監(jiān)測(cè)的效果及采樣豬場(chǎng)主要豬病病毒的感染分布情況，在63家生豬養(yǎng)殖場(chǎng)以欄舍為單位采集豬口腔液樣品，結(jié)合熒光定量PCR和常規(guī)PCR分別檢測(cè)本地區(qū)常見(jiàn)的7種豬病病毒，即豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒1型和2型、豬偽狂犬病病毒，以初步探索利用豬口腔液開(kāi)展豬場(chǎng)病原學(xué)監(jiān)測(cè)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 豬口腔液樣品來(lái)源于2018年1月—12月武漢市6個(gè)行政區(qū)(縣)的63家豬場(chǎng)的325個(gè)豬欄，包含35個(gè)商品代養(yǎng)殖場(chǎng)的180個(gè)豬欄、19個(gè)種豬場(chǎng)的100個(gè)豬欄、4個(gè)養(yǎng)殖小區(qū)20個(gè)豬欄和5個(gè)豬散養(yǎng)戶的25個(gè)豬欄。

1.1.2 試劑盒和主要儀器 磁珠法病毒總核酸抽提試劑盒，美基生物科技有限公司產(chǎn)品；豬瘟病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、口蹄疫病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Nsp2 1594-1680變異株)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬圓環(huán)病毒1型和2型雙重PCR檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Thermo KingFisher FLEX磁珠提取儀、ABI 7500型熒光PCR儀、Bio-Rad T100型PCR儀。

1.1.3 采樣用品 剪取100%純棉、直徑1.6 cm、長(zhǎng)度1.2 m的繩子，滅菌后轉(zhuǎn)入無(wú)菌自封袋保存；剪刀、離心管使用前進(jìn)行滅菌處理。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 在全年4個(gè)季度、武漢市6個(gè)生豬養(yǎng)殖集中的行政區(qū)(縣)分別采集不同類(lèi)型豬場(chǎng)的豬口腔液樣品。將棉繩懸掛于豬欄內(nèi)相對(duì)干凈的區(qū)域，遠(yuǎn)離飼喂、飲水和排便區(qū)，不接觸墻壁和豬欄。棉繩上端打結(jié)固定，下端懸掛高度與豬身肩關(guān)節(jié)齊平，任豬自由啃咬30 min。戴上一次性無(wú)菌手套，將棉繩下端的濕潤(rùn)部分放入一次性無(wú)菌自封袋中，用力擠壓袋內(nèi)棉繩，釋放口腔液至袋底。剪掉自封袋底部一角，將口腔液轉(zhuǎn)移至離心管中，置于低溫采樣運(yùn)輸箱中運(yùn)送。

1.2.2 樣品預(yù)處理 樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，4 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，去除雜質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌離心管中，做好標(biāo)記。

1.2.3 病原檢測(cè) 嚴(yán)格按照Magen磁珠法病毒總核酸抽提試劑盒對(duì)325份豬口腔液進(jìn)行核酸提取，按各種病毒檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明加入核酸樣品及相應(yīng)試劑進(jìn)行擴(kuò)增。豬瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2 1594-1680變異株(HP-PRRSV)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，豬偽狂犬病病毒(PRV)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，檢測(cè)樣品出現(xiàn)典型的S形擴(kuò)增曲線且Ct值小于37.0時(shí)為陽(yáng)性；豬圓環(huán)病毒1型和2型(PCV1和PCV2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與陽(yáng)性對(duì)照片段一致為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 7種病毒檢測(cè)結(jié)果

采用RT-PCR和常規(guī)PCR對(duì)所提取的豬口腔液核酸進(jìn)行CSFV、FMDV、PRRSV、HP-PRRSV、PCV1、PCV2和PRV的檢測(cè)，在325份豬口腔液中，檢出CSFV、FMDV、PRRSV、HP-PRRSV、PCV1和PCV2，PCV的檢出率最高，尤其是具有致病性的PCV2，共檢出PCV2陽(yáng)性樣品83份，陽(yáng)性率為25.54%，其次是PCV1，陽(yáng)性樣品為45份，陽(yáng)性率是13.85%，PRRSV、FMDV、HP-PRRSV、CSFV的陽(yáng)性率分別為7.38%、3.69%、0.92%和0.31%，PRV在口腔液的檢出率為0。7種病毒的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 7種病毒檢測(cè)陽(yáng)性率

2.2 4個(gè)季度病毒檢測(cè)結(jié)果

分別在全年的4個(gè)季度采集豬口腔液樣品，4個(gè)季度采集的樣品數(shù)量差異不大，第1季度采集85份，其他3個(gè)季度各80份。第1季度檢出CSFV、FMDV、PRRSV、HP-PRRSV、PCV1、PCV2共6種病毒，第3季度檢出FMDV、PRRSV、HP-PRRSV、PCV1、PCV2共5種病毒感染，第2季度、第4季度檢出FMDV、PRRSV、PCV1、PCV2共4種病毒；CSFV僅在第1季度檢出，陽(yáng)性率為0.31%，F(xiàn)MDV、PRRSV、PCV1、PCV2在4個(gè)季度均有檢出，HP-PRRSV僅在第1和第3季度檢出，陽(yáng)性率分別為2.35%和1.25%；PRRSV在第1季度的陽(yáng)性率最高(14.12%)，F(xiàn)MDV、PCV2在第2季度陽(yáng)性率最高，陽(yáng)性數(shù)分別為7份、36份，陽(yáng)性率分別為8.75%和45.00%，PCV1在第3季度陽(yáng)性率比PCV2高，為23.75%。4個(gè)季度各種病毒的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 不同類(lèi)型場(chǎng)點(diǎn)病毒檢測(cè)結(jié)果

為了解不同類(lèi)型場(chǎng)點(diǎn)的病毒感染情況，此次豬口腔液采集的場(chǎng)點(diǎn)包含商品代養(yǎng)殖場(chǎng)、種豬場(chǎng)、養(yǎng)殖小區(qū)和散養(yǎng)戶，樣品量占比見(jiàn)表1，所有樣品經(jīng)核酸檢測(cè)后顯示，商品代養(yǎng)殖場(chǎng)、種豬場(chǎng)檢出的病毒種類(lèi)比養(yǎng)殖小區(qū)、散養(yǎng)戶多。CSFV、HP-PRRSV僅在商品代養(yǎng)殖場(chǎng)檢出，F(xiàn)MDV在商品代養(yǎng)殖場(chǎng)和種豬場(chǎng)檢出，散養(yǎng)戶僅能檢出PCV1和PCV2。不同類(lèi)型場(chǎng)點(diǎn)PCV2檢測(cè)陽(yáng)性率均較高，散養(yǎng)戶的陽(yáng)性率最高，高達(dá)36.00%。不同類(lèi)型場(chǎng)點(diǎn)的豬口腔液病毒檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 不同季度病毒檢測(cè)陽(yáng)性率

表1 不同類(lèi)型場(chǎng)點(diǎn)采集的樣品量占比

1.商品代養(yǎng)殖；2.種豬場(chǎng)；3.養(yǎng)殖小區(qū)；4.散養(yǎng)戶

2.4 不同行政區(qū)病毒檢測(cè)結(jié)果

為了解通過(guò)豬口腔液監(jiān)測(cè)不同地域豬群病毒感染情況的可行性，此次樣品按存欄比例分布在6個(gè)主要生豬集中的行政區(qū)(縣)，不同區(qū)的樣品量占比見(jiàn)表2，樣品采集后經(jīng)病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示，6個(gè)區(qū)均存在PCV1和PCV2的感染，其中PCV1以A區(qū)和B區(qū)陽(yáng)性率最高，陽(yáng)性率分別為22.50%、45.00%，PCV2以A區(qū)和E區(qū)檢測(cè)陽(yáng)性率最高，分別為35.00%、33.33%，F(xiàn)MDV在A、D、E和F 4個(gè)區(qū)檢出，HP-PRRSV僅在A區(qū)和C區(qū)檢出，CSFV僅在C區(qū)檢出(圖4)。PCV1陽(yáng)性場(chǎng)點(diǎn)占抽樣場(chǎng)點(diǎn)的31.75%，PCV2陽(yáng)性場(chǎng)點(diǎn)占抽樣場(chǎng)點(diǎn)的53.97%，PCV1和PCV2混合感染占23.81%，說(shuō)明養(yǎng)殖區(qū)普遍存在豬圓環(huán)病毒2型感染(表3)。

表2 不同區(qū)采集的樣品量占比

圖4 不同區(qū)病毒檢測(cè)陽(yáng)性率

表3 PCV1/PCV2陽(yáng)性場(chǎng)占比

3 討 論

早期病原監(jiān)測(cè)是評(píng)估群體感染風(fēng)險(xiǎn)和動(dòng)物疫病凈化消除的有效手段，對(duì)減少動(dòng)物疫病的傳播和影響具有重要意義。動(dòng)物分泌液作為監(jiān)測(cè)動(dòng)物健康和疫病的新興遞質(zhì)，在疾病早期診斷中具有明顯的作用[19]。豬口腔液作為一種動(dòng)物分泌液，已廣泛應(yīng)用于多種豬病的病原檢測(cè)或抗體測(cè)定。研究證實(shí)，多種豬傳染性病原體通過(guò)口腔排毒，可能與口腔中病毒的定殖組織或循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)黏膜滲出的物質(zhì)有關(guān)，因此口腔液中含有機(jī)體感染后的病原，甚至有些病毒優(yōu)先于血液檢出，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒[17]、非洲豬瘟病毒[20]、水皰性口炎病毒[21]等。本文采集的豬群均為臨床正常豬，檢出病原核酸提示豬可能處于感染后的排毒期或潛伏期，應(yīng)用豬口腔液開(kāi)展病毒早期監(jiān)測(cè)具有可行性。口腔液是一種群體監(jiān)測(cè)樣品，一個(gè)樣品可覆蓋一個(gè)豬欄多頭豬，一旦檢出陽(yáng)性則可作為早期診斷的證據(jù)，而血清學(xué)監(jiān)測(cè)需采集豬欄中的每頭豬才能達(dá)到相同效果。對(duì)周期性監(jiān)控疫病來(lái)說(shuō)，血清學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)動(dòng)物的刺激性較大，不易重復(fù)采樣，對(duì)采集人員的技術(shù)要求也比較高，而豬口腔液樣品易于開(kāi)展后續(xù)多項(xiàng)試驗(yàn)，養(yǎng)殖業(yè)主可通過(guò)重復(fù)獲取并檢測(cè)豬口腔液持續(xù)監(jiān)測(cè)豬群不同階段的疫病狀態(tài)[22]。據(jù)報(bào)道[12,23]，PCR方法檢測(cè)口腔液樣品與檢測(cè)血清樣品相比，病原檢出陽(yáng)性率更高、檢出時(shí)間更早。

以欄舍為單位懸掛棉繩由豬啃咬后收集豬口腔液樣品，結(jié)合分子生物學(xué)方法監(jiān)測(cè)豬群病毒感染情況，結(jié)果顯示，在檢測(cè)的生豬養(yǎng)殖場(chǎng)中，口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬圓環(huán)病毒均能檢出(圖1)，尤其在春季這幾種病毒的檢出率較高(圖2)，這可能與病毒在低溫環(huán)境下更易存活有關(guān)，也可能與引種調(diào)運(yùn)導(dǎo)致的病原輸入相關(guān)；口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒在春夏交替之際的檢出率較高，晝夜溫差大、濕度高可能是導(dǎo)致這兩種病毒檢出率高的原因。不同場(chǎng)點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果提示，規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)檢出的病毒種類(lèi)比養(yǎng)殖小區(qū)、散養(yǎng)戶多，推測(cè)是受群體數(shù)量、種源及養(yǎng)殖密度影響，群體量大、種源復(fù)雜、養(yǎng)殖密集易造成病毒在群間傳播，病毒感染風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。另外，養(yǎng)殖小區(qū)和散養(yǎng)戶的樣本量少(6.15%和7.69%)也是導(dǎo)致散戶病毒種類(lèi)檢出低的主要原因(表1)。

豬圓環(huán)病毒的檢出率普遍較高，尤其是致病性更高的PCV2(圖1)，全年4個(gè)季度均能檢出(圖2)，存在于不同區(qū)(圖4)，雖然散養(yǎng)戶采集的樣本量少，但PCV2的檢測(cè)陽(yáng)性率卻最高(圖3)，提示本地區(qū)尤其是散養(yǎng)環(huán)節(jié)可能存在廣泛的PCV2污染。豬圓環(huán)病毒主要通過(guò)鼻液、口腔液、糞便、尿液排毒，可在血清、組織(淋巴結(jié)、肺、扁桃體、腎、肝、心)等檢出[22,24]，可引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征，一般情況下，感染PCV2僅引起亞臨床表現(xiàn)，但可導(dǎo)致豬群產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，從而繼發(fā)或并發(fā)其他傳染病。豬偽狂犬病病毒在試驗(yàn)中未檢出，結(jié)合本地區(qū)gE抗體監(jiān)測(cè)情況，理論上能檢測(cè)到病毒，零檢出的原因可能是，試驗(yàn)采集豬群主要為育肥豬、成年豬，感染PRV后一般癥狀較為輕微，耐過(guò)后可建立潛伏感染，此時(shí)并不向外界環(huán)境散發(fā)病毒[24]，口腔液中檢出病毒的概率較低。潛伏感染期豬偽狂犬病病毒DNA以附體的形式出現(xiàn)或插入感染部位(三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球和肺扁桃體等)的基因組中，但在應(yīng)激因子的刺激下可重新產(chǎn)生感染性病毒粒子，并通過(guò)口、鼻及生殖道分泌物等途徑向外排毒[25]。李段[26]用PCR檢測(cè)豬偽狂犬病陽(yáng)性豬場(chǎng)不同階段豬群的鼻拭子、肛拭子、唾液等樣品，鼻拭子、肛拭子和唾液樣品PRV的陽(yáng)性率分別為6.21%、5.65%和0.55%。Panyasing Y[13]用PCR檢測(cè)PRV攻毒豬的口腔液，發(fā)現(xiàn)攻毒后3 d～21 d PRV陽(yáng)性率在20%～100%之間。推測(cè)當(dāng)豬處于排毒期時(shí)，口腔液可檢測(cè)到病毒。豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、口蹄疫病毒雖然在試驗(yàn)中的檢出率不高，但這幾種病毒對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害較大，通過(guò)豬口腔液對(duì)規(guī)模化豬場(chǎng)病原普檢，可提前做出綜合防控措施。

試驗(yàn)結(jié)果表明，豬口腔液可用于檢測(cè)豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒，采集豬場(chǎng)存在普遍的豬圓環(huán)病毒感染，以欄舍為單位采集豬口腔液用于豬場(chǎng)病原監(jiān)測(cè)具備可行性。