謝欣序，劉 鵬，賈 靜，趙 文，嚴(yán) 麗，李 俊，馮育林，杜力軍,2，羅穎穎

(1．江西中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點實驗室，江西 南昌 330006；2.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084)

口腔粘膜炎是指口腔的炎性和潰瘍性反應(yīng)，為腫瘤患者放化療常見的幾種并發(fā)癥(如嘔吐、食欲降低、過敏反應(yīng)等)之一,臨床常表現(xiàn)為口腔異常疼痛，尤其在說話、進(jìn)食等刺激后更明顯，極大影響了患者的語言交流、正常進(jìn)食和睡眠，造成生活質(zhì)量明顯下降，甚者阻礙其進(jìn)一步治療。目前對于此類并發(fā)癥的治療多以含漱液、生理鹽水、錫類散等為主，但療效不佳。因此，尋找新的治療藥物具有重要意義[1]。

動物模型作為新藥臨床前藥效評價重要組成部分，在整個新藥研發(fā)中起到不可或缺的作用。目前口腔潰瘍動物模型的制備方法主要有化學(xué)燒灼法、創(chuàng)傷法、氧自由基法、細(xì)菌感染誘導(dǎo)法等[2-4]，這些模型各有特點，如化學(xué)法造模方法簡單，成功率高，重復(fù)性好，但不能模擬口腔潰瘍的復(fù)發(fā)情況；免疫法所致潰瘍發(fā)生的病理過程和人類復(fù)發(fā)性口腔潰瘍最為接近，但此法較復(fù)雜、耗時長，潰瘍發(fā)生部位及數(shù)量不固定，成功率不高；機械損傷法與臨床單純創(chuàng)傷引起口腔潰瘍接近。這些模型在藥物治療口腔潰瘍的藥效評價中得到了廣泛的應(yīng)用[5-7]?；熕幷T導(dǎo)的口腔潰瘍模型鮮有報道和運用[8-9]。為進(jìn)行進(jìn)一步探索，本實驗擬選用臨床常用且會引起口腔黏膜炎或口腔潰瘍并發(fā)癥的幾種化療藥物，通過局部黏膜內(nèi)注射進(jìn)行大鼠口腔潰瘍模型的探索，以期尋找到一種穩(wěn)定可靠的化療藥導(dǎo)致的口腔潰瘍模型，為口腔潰瘍的新藥研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

SD大鼠,SPF級，42只，♂，(200-220) g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,合格證號：43004700064531,許可證號：SCXK(湘)2016-0002，購進(jìn)動物在恒溫(22-26) ℃恒濕(40%-60%)，12 h明暗交替條件下飼養(yǎng)。所有操作都符合江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理學(xué)要求。

順鉑注射液(cisplatin injection，DDP)，江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，批號190201；紫杉醇注射液(paclitaxel injection，PTX)，北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，批號20190101；注射用硫酸長春新堿(vincristine sulfate for injection，VLB)，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號1403V2；注射用鹽酸多柔比星(doxorubicin for injection，ADM)，瀚暉制藥有限公司，批號19006111；甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)，武漢東康源科技有限公司，批號20190730；TRIzol，ambion,批號204212；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo scientific,批號00621709；Syber Green 染料，applied biosystems,批號0075497；紅細(xì)胞裂解液，康為世紀(jì)；APC anti-rat CD3,FITC anti-rat CD4,PE anti-rat CD8,BioLegend。

普通PCR儀(Eppendorf，mastercycler)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，ABI-7500)，流式細(xì)胞儀(Beckman，Gallios)，脫水機(浙江金華科迪，KD-TS3A)，包埋機(孝感亞光醫(yī)用，YB-6LF)，切片機(LECIA，RM2016)，顯微鏡(LECIA,DM4B)，RNA純度測定儀(Thermo，NanoDrop One)。

2 方法

2.1 動物分組將適應(yīng)性喂養(yǎng)后的SD大鼠隨機分為甲氨蝶呤組、順鉑組、紫杉醇組、長春新堿組和阿霉素組，每組7只。各組均以各藥物最高可注射濃度為造模劑量(分別為甲氨蝶呤100 mg·L-1，順鉑5 mg·L-1，紫杉醇6 mg·L-1，長春新堿組1 mg·L-1，阿霉素8 mg·L-1，其中阿霉素組為最大耐受劑量)，按每只50 μL注射體積計算，各組造模劑量分別為甲氨蝶呤組25 mg·kg-1，順鉑組1.25 mg·kg-1，紫杉醇組1.5 mg·kg-1，長春新堿組0.25 mg·kg-1，阿霉素組2 mg·kg-1，另設(shè)生理鹽水對照組7只。

2.2 化療藥誘導(dǎo)大鼠口腔潰瘍模型建立各模型組分別大鼠右側(cè)口腔頰膜黏膜內(nèi)注射相應(yīng)濃度的化療藥物，注射體積為50 μL/只。對照組注射生理鹽水，各組動物造模當(dāng)天注射1次，造模后連續(xù)觀察7 d。

2.3 體質(zhì)量觀察造模開始后，每2 d記錄一次動物體質(zhì)量，觀察動物的一般情況及體質(zhì)量變化。

2.4 攝食量觀察造模后禁食24 h,造模次日每組定量給予食物，記錄每籠動物的攝食量，并計算平均每只動物每日攝食量。

2.5 潰瘍?nèi)庋塾^察造模后24 h，觀察記錄潰瘍形成情況，包括潰瘍的出現(xiàn)率，潰瘍外形及大小，觀察記錄潰瘍愈合情況及愈合時間，愈合標(biāo)準(zhǔn)為黏膜上皮完全愈合，用鑷子輕碰不會出現(xiàn)出血情況。

2.6 動物臟器指數(shù)觀察造模后d 7,處死動物，剪取大鼠的胸腺和脾臟稱重，并計算各組動物的臟器指數(shù)，臟器指數(shù)/%=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.7 潰瘍組織病理學(xué)觀察造模后d 7,各組動物隨機選取3只，剪取大鼠右側(cè)口腔頰膜黏膜造模部位組織放入10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察口腔黏膜組織病理學(xué)變化并拍照。

2.8 潰瘍局部炎癥因子表達(dá)造模后d 7,各組選取3只動物，剪取大鼠右側(cè)口腔頰膜黏膜造模部位組織，剔除黏膜下多余肌肉等組織，留取黏膜，放置液氮速凍后，剪碎，加入TRIzol勻漿，提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用Q-PCR技術(shù)檢測組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、EGFR等mRNA表達(dá)情況。根據(jù)NCBI設(shè)計各引物序列，由深圳華大基因股份有限公司合成。各引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequence list of each primer

2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8表達(dá)造模后d 3和d 7,大鼠眼眶后靜脈叢取血,肝素抗凝，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞(按試劑盒操作步驟)后,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清，100 μL含2%血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上孵育APC anti-rat CD3、FITC anti-rat CD4、PE anti-rat CD8抗體20 min，2%血清的PBS洗2遍，200目尼龍網(wǎng)濾過，流式細(xì)胞儀檢測外周血中淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 造模后各組動物體質(zhì)量的變化由Fig 1可以看出，各造模組動物在造模后，體質(zhì)量增長不明顯，在造模d 3-d 6，增長明顯比正常組緩慢，與對照組相比，體質(zhì)量明顯減輕(P<0.05)，造模d 7開始體質(zhì)量有所增長，除順鉑組外，其余各組體質(zhì)量與正常組沒有明顯差異。

Fig 1 Body weight of rats in each group after modeling (,n=7)PTX:Paclitaxel group;DDP:Cisplatin group;ADM:Doxorubicin group;VLB:Vincristine group;MTX:Methotrexate group.*P<0.05

Fig 2 Food consumption changes of each group rats after modeling (,n=3)*P<0.05 vs control.

3.2 造模后各組動物攝食量的變化由Tab 2可以看出，與對照組比，各組動物在造模后攝食量減少，以造模d 3攝食量最低，然后逐漸恢復(fù)，其中在造模d 3和d 4，各造模組和正常組相比，攝食量明顯減少(P<0.01),造模d 5，順鉑組和阿霉素組及造模d 6,順鉑組動物攝食量與正常組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模d 7,各造模組動物攝食量基本恢復(fù)，和正常組動物攝食量相當(dāng)。

3.3 造模后各組動物口腔潰瘍形成情況與對照組比，模型組各組動物口腔造模側(cè)均出現(xiàn)腫脹，刺激疼痛反應(yīng)強烈，其中以阿霉素最為明顯。順鉑組與紫杉醇組動物造模側(cè)黏膜出現(xiàn)明顯的潰瘍面，表現(xiàn)為潰瘍中央凹陷，邊緣紅腫，表面有化膿跡象，形狀基本為規(guī)則圓形。而長春新堿組、阿霉素組和甲氨蝶呤組動物造模側(cè)除了明顯腫脹，并未見黏膜潰瘍形成。見Fig 3。

Fig 3 Formation of ulcers after modeling in various groups of ratsA.Control group;B.Cisplatin group;C.Vincristine group;D.Paclitaxel group;E.Doxorubicin group;F.Methotrexate group

Fig 4 Changes in diameter of ulcers after modeling in PTX and DDP groups of rats (,n=7)#P<0.05 vs DDP groups.

Fig 5 Organ index of rats in each group on the 7th day of modeling (,n=7)*P<0.05 vs control.

Fig 6 HE staining of mucosal tissues of rats in each group after modeling(×40)A：Control group;B：Cisplatin group;C：Vincristine group;D：Paclitaxel group;E：Doxorubicin group;F：Methotrexate group.Arrows indicate:epithelial shedding and defect.

造模d 2開始觀察大鼠口腔黏膜潰瘍形成情況，對有潰瘍形成的大鼠進(jìn)行口腔黏膜潰瘍直徑測量，本次實驗在順鉑組和紫杉醇組中觀察到潰瘍的形成，兩者潰瘍直徑變化趨勢一致，呈先升高后降低的趨勢，在d 3潰瘍直徑最長。在d 2和d 3紫杉醇組潰瘍直徑和順鉑組比較明顯升高，且差異有顯著性，整個觀察周期，可以看出紫杉醇組所致的潰瘍直徑更大，更明顯一些。

3.4 造模后d 7各組動物臟器指數(shù)造模d 7，取各組動物胸腺及脾臟，并計算其臟器指數(shù)，阿霉素組在造模d 7，其胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)與對照組比較明顯下降，且差異有顯著性；長春新堿組胸腺指數(shù)與對照組比較明顯下降，且差異有顯著性；甲氨蝶呤組脾臟指數(shù)與對照組比較明顯下降，且差異有顯著性。

3.5 造模后各組動物口腔黏膜組織病理學(xué)變化情況從黏膜組織HE染色看，對照組黏膜層上皮細(xì)胞排列整齊，黏膜完整；順鉑組和紫杉醇組黏膜上皮細(xì)胞層(如箭頭所示)明顯的脫落，缺損，但無明顯炎性細(xì)胞浸潤。甲氨蝶呤組、阿霉素組和長春新堿組黏膜上皮層結(jié)構(gòu)完整，僅可見黏膜下導(dǎo)管腔擴張等。

3.6 局部炎癥及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)比較從炎性因子表達(dá)來看，造模7 d后，與對照組比較，紫杉醇組、順鉑組、阿霉素組的IL-1βmRNA表達(dá)明顯升高；與對照組比較，紫杉醇組IL-6mRNA表達(dá)明顯升高，甲氨蝶呤組的IL-6mRNA表達(dá)明顯降低，差異有顯著性；甲氨蝶呤組、長春新堿組在TNF-α mRNA與對照組比較，明顯下降。順鉑組、長春新堿組、紫杉醇組在EGFR mRNA表達(dá)有明顯降低。見Fig 7。

3.7 造模動物外周血中T淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8的表達(dá)情況從外周血淋巴細(xì)胞中CD3、CD4、CD8分類來看，d 3、d 7，各造模組中CD3+CD4+CD8-細(xì)胞、CD3+CD8+CD4-細(xì)胞與對照組差異無顯著性，且CD4+/CD8+比值與對照組無差異。見Fig 8。

Fig 7 Local mucosal inflammatory and related cytokine mRNA expression (,n=3)1：Control;2:PTX;3:DDP;4:ADM;5:VLB;6:MTX.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

Fig 8 Expression of peripheral blood T lymphocytes (,n=7)A and B:The ratio of CD4+ and CD8+ cells in the peripheral blood of each group on the 3rd and 7th day of;C:The change of the ratio of CD4+/CD8+ in the peripheral blood of each group on the 3rd and 7th day;D and E:The changes in the peripheral blood of each group on the 3rd and 7th day of flow cytometric diagram of T cell classification.a.Control group;b.Cisplatin group;c.Vincristine group;d.Paclitaxel group;e.Doxorubicin group;f.Methotrexate group

4 討論

化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，對口腔黏膜細(xì)胞也有直接損傷作用，它可以阻斷口腔上皮細(xì)胞周期，而使口腔黏膜上皮細(xì)胞不能分裂和增殖，引起口腔黏膜發(fā)生潰瘍，且潰瘍多發(fā)生在口唇黏膜、雙頰黏膜、口底黏膜和上腭黏膜等部位。臨床報道易引起口腔潰瘍的化療藥物有甲氨蝶呤、阿霉素、5-氟尿嘧啶、順鉑、長春新堿、紫杉醇等，尤其以甲氨蝶呤為最常見[10]。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，選用甲氨蝶呤、順鉑、紫杉醇、阿霉素幾種常用的化療藥物通過局部黏膜內(nèi)注射進(jìn)行口腔潰瘍模型摸索，結(jié)果表明，順鉑和紫杉醇注射液組動物出現(xiàn)了明顯潰瘍，相比免疫法誘導(dǎo)的口腔潰瘍模型出現(xiàn)的潰瘍出現(xiàn)部位，大小不均一和固定，該模型更便于觀察；后期實驗還發(fā)現(xiàn)，潰瘍形成的動物造模1周后還能見到明顯潰瘍，后續(xù)實驗顯示潰瘍愈合時間為10-14 d,與化學(xué)損傷法誘導(dǎo)的潰瘍愈合期6-9 d相比，時間窗更長，更有利于觀察藥物的治療效果。從組織病理學(xué)來看，與化學(xué)損傷法誘導(dǎo)的潰瘍不同，順鉑組和紫杉醇組的黏膜上皮細(xì)胞層雖明顯的脫落、缺損，但無明顯炎性細(xì)胞浸潤。

口腔潰瘍會導(dǎo)致口腔異常疼痛，疼痛會影響口腔功能，包括營養(yǎng)的攝入等[11]。對動物口腔內(nèi)疼痛的研究，有使用麻醉大鼠和肌電圖來測量機械和/或熱刺激后的頭部退縮反射來反應(yīng)動物疼痛程度，也有使用清醒動物來評價的，前者會因為全身麻醉而影響到中樞和外周的疼痛知覺，使結(jié)果不易判斷；后者需要一些特殊設(shè)備來檢測?；诖耍毡緦W(xué)者Suzuro用局部給予口腔潰瘍大鼠辣椒素刺激，觀察大鼠用前肢搓嘴或擦臉的次數(shù)來評價大鼠的疼痛程度，或者用磁化針穿刺大鼠下唇外周皮膚，通過一個4 g重物的牽拉穩(wěn)定暴露口腔黏膜潰瘍處，再用Von-Frey絲刺激，測量刺激引起的頭部退縮閾值，以評估機械疼痛閾值[12-13]?？紤]這些方法的可行性受諸多因素影響，且口腔黏膜損傷屬于局部的病變，其疼痛是由于破損黏膜下神經(jīng)末梢暴露相關(guān)。攝食可以刺激神經(jīng)末梢而產(chǎn)生疼痛。因此攝食量的變化與黏膜損傷存在相關(guān)性。因此本實驗觀察了動物的攝食量，發(fā)現(xiàn)造模后紫杉醇組和順鉑組動物攝食量比正常組動物明顯減少，這與針對放療引起的口腔黏膜炎患者口腔功能變化的臨床前瞻性多中心研究結(jié)果一致，該研究結(jié)果表明放療引起的口腔黏膜炎患者吞咽固體食物量明顯下降(P<0.000 1)，口腔健康相關(guān)生活質(zhì)量明顯降低[14],因此，本實驗認(rèn)為攝食量的變化可以間接反映造模后大鼠的狀態(tài)及疼痛程度。

放化療所導(dǎo)致的口腔黏膜炎病理過程主要由開始、初始的損傷反應(yīng)，信號放大，潰瘍和愈合5個階段組成。放化療對黏膜的上皮細(xì)胞產(chǎn)生直接損害，氧化損傷開始，隨之大量轉(zhuǎn)錄因子激活，引起一系列的炎癥反應(yīng)，炎癥效應(yīng)放大，加重黏膜組織的損傷，導(dǎo)致潰瘍的形成。在這一過程中，炎癥細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等起了非常重要的作用[15]。IL-6由T、B淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等細(xì)胞分泌，生理狀態(tài)下，上皮組織中含有少量IL-6,而在口腔黏膜炎組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與口腔黏膜炎的嚴(yán)重程度成正相關(guān)，文獻(xiàn)研究表明，在大鼠放射性口腔黏膜炎中，IL-6在舌黏膜組織中的表達(dá)隨黏膜炎的加重而增多[16]。和IL-6一樣，IL-1β和TNF-α也是這一階段重要的炎癥因子，除了直接損傷黏膜，還可以引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過放療后的患者，口腔黏膜組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平明顯升高，與口腔黏膜炎癥嚴(yán)重程度成正相關(guān)[17]。本次實驗也觀察到，黏膜出現(xiàn)明顯潰瘍的紫杉醇組和順鉑組，局部黏膜組織IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯升高，并且，紫杉醇組IL-6m RNA表達(dá)水平也明顯升高，順鉑組IL-6m RNA表達(dá)水平較正常組有升高趨勢；兩組動物TNF-αm RNA的表達(dá)表現(xiàn)出升高趨勢；而甲氨蝶呤組和長春新堿組的IL-6，IL-1β和TNF-αm RNA水平表達(dá)明顯降低或有降低趨勢，這與臟器指數(shù)的結(jié)果一致，考慮由于免疫抑制造成。

在潰瘍愈合的階段，與口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖和分化、再生密切相關(guān)的EGFR起到了關(guān)鍵作用。EGFR普遍表達(dá)于表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，在正?？谇火つそM織中可以檢測到EGFR的表達(dá)，而在口腔潰瘍的黏膜組織中表達(dá)明顯下降，本實驗也觀察到，潰瘍明顯形成的紫杉醇組和順鉑組，局部黏膜組織的EGFR mRNA表達(dá)水平明顯下降，與文獻(xiàn)報道一致[18]。

另外本實驗通過脾臟、胸腺指數(shù)，外周血CD4/CD8比例變化，觀察了動物的免疫狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，潰瘍明顯形成的紫杉醇組和順鉑組，臟器指數(shù)和CD4/CD8比值均沒有明顯變化，而阿霉素、甲氨蝶呤和長春新堿組對動物脾臟、胸腺等免疫器官有明顯的抑制作用，但CD4/CD8比值無明顯變化，由此可見，在本模型中，動物的免疫狀態(tài)和潰瘍形成不成比例關(guān)系。

綜上，通過本實驗的研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素、甲氨蝶呤和長春新堿雖然免疫抑制明顯，但未能直接觀察到局部口腔潰瘍的形成，而化療藥順鉑、紫杉醇經(jīng)大鼠口腔黏膜內(nèi)局部注射，可以形成穩(wěn)定的口腔潰瘍模型，從潰瘍直徑/面積、攝食量、局部細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)表達(dá)變化等方面可以評價藥物對化療藥誘導(dǎo)的大鼠口腔潰瘍的治療作用，操作簡單，潰瘍形成穩(wěn)定，可重復(fù)性強。因受樣品限制，本實驗中IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)僅在mRNA水平進(jìn)行觀察，還需要在蛋白水平進(jìn)行進(jìn)一步驗證，此外，該模型局部黏膜細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)是一個動態(tài)變化過程，需進(jìn)一步研究以更全面了解該模型的特點。