王冬青，高 莉，孔 征，閆 明

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)變性病，以進(jìn)行性記憶力減退和獲得性知識喪失，直至日常生活活動能力完全喪失為特征，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)，成為嚴(yán)重的社會和醫(yī)療衛(wèi)生問題[1]。因此，在AD的藥物治療中，療效較高且毒副作用小的新型創(chuàng)新藥物研究成為當(dāng)前有效干預(yù)治療AD的重要措施。但是AD的發(fā)病機制比較復(fù)雜，越來越多的證據(jù)顯示，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期失調(diào)與AD有密切關(guān)系，影響著神經(jīng)元的易損性和神經(jīng)變性的途徑。AKT、NF-κB與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)節(jié)機制環(huán)節(jié)密切相關(guān)，影響細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控[2]。眾多研究結(jié)果也表明，許多細(xì)胞的繁殖和生存均受到AKT、NF-κB調(diào)控的影響，通過配體與受體之間的相互作用，激活下游信號級聯(lián)介質(zhì)[3]。一些研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦神經(jīng)元的凋亡率顯著高于正常人，眾多相關(guān)凋亡基因體現(xiàn)為高表達(dá)，故認(rèn)為由凋亡基因介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致AD的主要原因[4]。目前研究的熱點在于對凋亡基因的調(diào)控，大量研究發(fā)現(xiàn)PI3-K/AKT信號通路是促細(xì)胞存活的通路之一，PI3-K在生長因子受體等胞外信號活化后，激活下游蛋白激酶AKT，活化的AKT可以磷酸化凋亡基因，進(jìn)凋亡基因失活，從而抑制神經(jīng)元凋亡以及促進(jìn)神經(jīng)元的存活。NFκB作為信號傳導(dǎo)途徑的樞紐，與免疫、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等聯(lián)系密切，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，而NFκB活化過度是引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要原因。本課題的研究對象，類葉升麻苷(acteoside，AS)是苯乙醇苷類主要藥效成分之一，課題組前期對其改善腦損傷、改善學(xué)習(xí)記憶障礙、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等方面也進(jìn)行了研究[5]。AS能有效減輕神經(jīng)元損傷，起到神經(jīng)元功能保護(hù)作用、調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，進(jìn)而減輕神經(jīng)元損害發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用[6-7]。為了進(jìn)一步探討AS增強學(xué)習(xí)記憶的作用和機制，本實驗從AKT、NF-κB抑制細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的角度，探究AS對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型學(xué)習(xí)記憶的改善作用。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑AS(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制，純度 ≥98%，批號 201708)，鹽酸多奈哌齊片[衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，批號1704062]，Anti-NF-κB p65(abcam，ab16502)，Anti-NFκB p65 phoshpo S536(abcam ab76302)，AKT Rabbit PolyAb (Proteintech，10176-2-AP)，p-AKT(Ser473)(ST，4060s)，phospho-AKT(Thr308)(ST，4056s)。

1.2 儀器IVC-Ⅱ型獨立送風(fēng)隔離籠具(蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司)，XR-XY1032曠場視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)，Go1510全波長酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific Oy RatAStie 2.FL-01620 Vantaa.Finland)，Allegra 64R 離心機(BECKMAN)，TL2010S高通量組織研磨儀(SOP-EQ036)，SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，L92-1溫度及濕度黑匣子(杭州路格科技有限公司)，F(xiàn)JY2002-UV基因研究型超純水機(青島宮勒姆科技有限公司)，IMS-40全自動雪花制冰機(杭州三永德儀器儀表有限公司)，LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，電泳儀(OMKS001，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)，搖床(1704625，海門市其林貝爾儀器制造有限公司，凝膠成像系統(tǒng)(20150168，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 實驗動物本實驗所需的SPF級小鼠共60只(C5710只，APP/PS1模型鼠50只♀♂各半)，許可證號：SCXK(京)2019-0008，單位名稱：北京華阜康生物科技股份有限公司。購買4月齡小鼠，體質(zhì)量(17-24) g。飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所SPF級動物房，單籠飼養(yǎng)。室溫(21-25) ℃，相對濕度50%-60%，12 h明暗交替飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.4 分組及給藥根據(jù)北京華阜康生物科技股份有限公司出具的基因證明對動物進(jìn)行基因篩選，并通過Y迷宮篩選行為異常的小鼠，篩選出60只合格動物，♀♂各半，隨機分成6組。連續(xù)60 d每天灌胃給藥1次，每組給藥劑量為0.1 mL·10 kg-1，配制方法如下：正常對照組：(C57小鼠)，超純水；模型組：(APP/PS1小鼠)，超純水；多奈哌齊組：稱取鹽酸多奈哌齊片 56 mg，混懸于10 mL超純水后以2 mg·kg-1給藥；AS低劑量組：稱取AS 25 mg，混懸于10 mL超純水以25 mg·mg·kg-1給藥；AS中劑量組：稱取AS 50 mg，混懸于10 mL超純水以50 mg·mg·kg-1給藥；AS高劑量組：稱取AS 100 mg，混懸于10 mL超純水以100 mg·mg·kg-1給藥。

1.5 筑巢實驗筑巢實驗考察動物的社會活動及日常行為能力，分別于給藥前、給藥d 30、60進(jìn)行筑巢實驗。將已裁剪好的大小相同的32塊5 cm × 5 cm的正方形紙屑均勻的散布在小鼠籠內(nèi)，使小鼠自由在籠內(nèi)自由活動12 h后，按照以下評分法對小鼠筑巢行為進(jìn)行盲評，以此作為小鼠筑巢的成績，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。1分，紙張仍然散落在籠子里，沒有咬痕；2分，紙張聚集到籠子的一側(cè)，但松散，沒有形狀明顯的巢和顯著的咬或折；3分，紙張聚集在一起但為相對扁平的巢穴，沒有明顯的咬痕；4分，紙張聚集形成一個深窩，并有明顯的咬痕。

1.6 新物體識別實驗新物體識別實驗(novel object recognition task,NORT)，用于考察小鼠非空間認(rèn)知行為能力。整個實驗分為3個階段，適應(yīng)期是讓小鼠適應(yīng)環(huán)境，將小鼠背對操作者輕輕放入新物體識別實驗箱正中格，使其在開闊的箱體中適應(yīng)環(huán)境20 min，之后放回飼養(yǎng)籠；學(xué)習(xí)期是讓小鼠接觸適應(yīng)3 d。在箱體的一側(cè)壁的左右兩端放置兩個完全相同的物體a1及物體a2，使其熟悉探究物體及環(huán)境10 min。最后一階段為測試期：a1不變，a2跟換為b，新物體于舊物體等高等直徑，再次放入小鼠探索5 min，測試全過程視屏錄像，記錄小鼠探查新物體總時間Tb、總次數(shù)和探查舊物體總時間Ta、總次數(shù)以及優(yōu)先指數(shù)Preferential index(P.I)等指標(biāo)，(P.I=[Tb/(Ta+Tb)×100%]檢驗小鼠的認(rèn)知能力，評價小鼠對事物的辨認(rèn)及記憶能力。

1.7 標(biāo)本采集及處理摘眼球取血，取小鼠大腦，冰上剝離腦組織，迅速分離出皮層和海馬，分別裝于已知重量的EP管中，稱質(zhì)量后通過差減法計算質(zhì)量，置于-80 ℃冰箱備用。

1.8 Western blot檢測AKT、NFκB及相關(guān)蛋白的表達(dá),首先用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌，經(jīng)組織研磨儀裂解，離心，酶標(biāo)儀蛋白定量，最后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，60 V電壓轉(zhuǎn)膜后封閉，孵育一抗4 ℃過夜，孵育二抗,顯色，曝光。

2 結(jié)果

2.1 AS對小鼠筑巢實驗的影響筑巢實驗結(jié)果顯示(Fig 1，Tab 1)。在給藥前及給藥30 d各組并未出現(xiàn)顯著差異，總體評分在3分左右，給藥60 d結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組評分顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，AS低、中、高劑量組的評分均顯著提升(P<0.05)，陽性藥多奈哌齊組評分也有提升，但未出現(xiàn)顯著性差異。這表明長期給藥，AS可以改善模型小鼠的筑巢行為能力。

Fig 1 Effect of AS on nesting experiments in APP/PS1 mice (,n=10)*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group

Tab 1 Effect of AS on nesting scores of APP/PS1 mice (,n=10)

2.2 AS對小鼠新物體識別實驗的影響NORT結(jié)果顯示(Fig 2，Tab 2)，在NORT測試期間，與正常組相比，模型組PI值降低(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組及AS給藥組PI值均顯著提升(P<0.05)。同時，模型組在新物體停留的時間較正常組顯著降低，正常組在新物體停留時間為模型組的2.71倍；與模型組相比，AS中、高劑量組在新物體的停留時間顯著增加，分別為模型組停留時間的2.60、2.75倍(P<0.01)，AS低劑量組與多奈哌齊組相比雖沒有顯著性差異，但均有提高的趨勢，在新物體的停留時間為模型組的1.98倍。其次，與正常組相比，模型鼠對新舊物體的總探索時間顯著減少(P<0.01)，正常組的總探索時間是模型組的2倍，與模型組相比，AS各給藥組同的陽性藥多奈哌齊一致，均有顯著提升。而各組小鼠在舊物體的停留時間沒有顯著性差異。

Tab 2 Effect of AS on object recognition memory of APP/PS1 mice (,n=10)

2.3 AS對APP/PS1模型鼠AKT及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響經(jīng)Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 3)，在海馬中，與正常組比較，模型組小鼠p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT比值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，多奈哌齊組及AS低、中、高劑量組小鼠p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT比值均顯著升高(P<0.01)。同時，在皮層中，與正常組比較，模型組小鼠p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT比值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，AS低、中、高劑量組同多奈哌齊結(jié)果一致，p-AKT-473/AKT比值均有不同程度的升高(P<0.01或P<0.05)，對于p-AKT-308/AKT，AS低劑量組作用明顯，中、高劑量雖未出現(xiàn)顯著性差異，但有上升的趨勢。

Fig 2 Effect of AS on object recognition memory in APP/PS1 mice (,n=10)*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

2.4 AS 對APP/PS1模型鼠NF-κB及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響NFκB蛋白表達(dá)結(jié)果顯示(Fig 4)，在海馬組織中，與正常組相比，模型組NFκB p-p65/NFκB p65表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，陽性藥多奈哌齊及AS各給藥組均可顯著降低NFκB p-p65/NFκB p65的表達(dá)(P<0.01)，其中AS低劑量作用最明顯，比值降低21.95%。同時，在皮層中,與正常相比，模型組中的NFκB p-p65/NFκB p65比值顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥多奈哌齊及AS低中高劑量均可顯著降低NFκB p-p65/NFκB p65的表達(dá)(P<0.01)，這說明AS能下調(diào)NFκB的表達(dá)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

Fig 3 AS expression of AKT and phosphorylation sites Thr308,Ser473 proteins in mice(，n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

Fig 4 Effect of AS on NFκB p-p65/NFκB p65 protein expression in mice ±s, n=3)**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

3 討論

筑巢實驗方法簡單易行，無太大的應(yīng)激刺激，可反映小鼠的社會行為和日常生活能力，已被作為動物行為學(xué)的一種新的手段與方法。給藥60 d發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組評分顯著降低，模型組小鼠多表現(xiàn)為無形狀明顯的巢或者巢相對扁平，紙張無明顯的咬痕；而AS給藥組評分顯著提升。這表明長期給藥，AS可以改善模型小鼠的筑巢行為能力。NORT實驗對動物來說無任何壓力，也不要求空間定位。它長期以來被用來衡量各種AD模型動物的學(xué)習(xí)和記憶能力。在NORT測試期間，模型組PI值降低，在新物體停留的時間降低，對新舊物體的總探索時間減少；而AS可以提升PI值，增加癡呆小鼠在新物體的停留時間和探索時間。說明阿爾茨海默癥小鼠對新物體探索興趣較低，AS可提高AD小鼠探索新物體的能力，使其在新事物處保持更長的停留時間，改善APP/ PS1癡呆小鼠的記憶，提升其對新物體的探索興趣。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能障礙出現(xiàn)的月齡一般在6-8月齡，故本實驗選取6月齡小鼠進(jìn)行早期干預(yù)[8]。此時段動物模型正處于 Aβ 沉積的早期階段，出現(xiàn)的行為學(xué)障礙與AD患者病程早期認(rèn)知功能障礙相似，能較好的模擬疾病狀態(tài)。AKT為絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶激酶，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子，在維持細(xì)胞正常生理功能及細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[9]。AKT是強有力的下游底物Bad激酶,活化的AKT可以使Bad的Ser136位點磷酸化,從而阻斷Bad誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而磷酸化位點Thr308和Ser473可以使AKT激活，從而抑制凋亡，促進(jìn)增殖[10]。本次實驗中發(fā)現(xiàn)，在海馬及皮層中，模型組小鼠p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT比值較正常組顯著降低；AS 可以顯著升高p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT。說明AS的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其對PI3K/AKT信號通路的激活有關(guān)，恢復(fù)了部分凋亡細(xì)胞的功能，減少了細(xì)胞凋亡的系列反應(yīng)，從而起神經(jīng)保護(hù)作用。

AKT的活性變化與核轉(zhuǎn)錄因子NFκB密切相關(guān)，在諸多生物學(xué)效應(yīng)中，活化態(tài)的AKT可磷酸化IкB激酶(IкB kinase，IKK)，IKK活化而降解NFκB，而NFκB在執(zhí)行和控制細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，它能夠促進(jìn)促凋亡基因如天冬氨酸特異的半耽氨酸蛋白激酶家族等的表達(dá)，從而促進(jìn)組織細(xì)胞凋亡[11]。NFκB是一個由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族，以各種同源或異源的NFκB/Rel構(gòu)成的一種二聚體蛋白，其中p65/p50異源二聚體發(fā)揮主要作用[12]。NFκB的激活可以使膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、自由基生成增多、誘發(fā)細(xì)胞凋亡，Aβ的增多和沉積、形成、神經(jīng)元損傷及丟失，所以神經(jīng)細(xì)胞中NFκB活化過度是引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡和包括AD在內(nèi)的退行性病變的主要原因[13]。溫蒲圓[14]研究表明，Aβ通過激活NFκB通路對體外培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。本次實驗結(jié)果顯示，在海馬及皮層組織中，模型組NFκB p-p65/NFκB p65表達(dá)量顯著升高，AS可顯著降低NFκB p-p65/NFκB p65的表達(dá)。這說明AS能下調(diào)NFκB的表達(dá)，提示AS可能通過抑制NFκB的活性來減少Aβ的毒性作用，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，為后續(xù)實驗提供了一定的依據(jù)，而明確的作用機制，有待于進(jìn)一步深入研究。