路青瑜，郭 麗，張啟云，楊付梅，李 嬌，孫黔云

(貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550014)

內(nèi)皮細(xì)胞作為機(jī)體重要的代謝和內(nèi)分泌器官，在調(diào)節(jié)血管功能方面起著重要作用[1]，其活化和損傷與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變等多種心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。在損傷細(xì)胞的諸多因素中，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是一個(gè)重要因素。LPS作為刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的強(qiáng)效物質(zhì)，在膿毒癥、中毒性休克、全身性炎癥反應(yīng)綜合征和多臟器功能障礙綜合征中扮演了重要的角色。干預(yù)LPS的炎癥損傷一直是研究的熱點(diǎn)。黃芩苷(Baicalin)是傳統(tǒng)中藥黃芩中的重要活性成分，具有清熱解毒、抗腫瘤、降糖降脂、保肝及抗炎等作用[4]。近年來研究表明黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷具有干預(yù)作用[5-7]，但其保護(hù)作用及機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。本研究基于前期的篩選，開展了黃芩苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制研究，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和挖掘黃芩苷的藥理活性。

1 材料

1.1 試劑胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)于阿根廷Natocor-Industria Biológica公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Toll-like Receptor 4(TLR4)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司(貨號(hào)：sc-293072)；NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司，貨號(hào)分別為8242S、3033S、4970S；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、Lipo6000TM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、BCA蛋白定量試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、ECL超敏顯影液、NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)試劑盒、鈣離子熒光探針Fluo-4 AM均購(gòu)自于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自于北京索萊寶生物科技有限公司(貨號(hào)：SB8020)；腫瘤壞死因子重組蛋白TNF-α購(gòu)自北京義翹神州生物科技有限公司(貨號(hào)：10602-HNAE)；細(xì)胞間黏附分子1(intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)、單核細(xì)胞趨化因子1(Monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)分別為P8765、L6529；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；TS2-S-SM倒置相差顯微鏡、TS2-FL倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；NovoCyte 2040R流式細(xì)胞儀(美國(guó)ACEA公司)；連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Gen5(美國(guó)Bio Tek公司)；高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)CellInsight CX5(美國(guó)Thermo公司)；ESCO CLM-170B-8-NF CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；GloMax 96化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(美國(guó)Promega公司)；Fusion Fx Spectra化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(法國(guó)Vilber Lourmat公司)；Milli-Q Integral 超純水系統(tǒng)(美國(guó)Milipore公司)；電泳、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(human microvasular endothelial cell，HMEC)HMEC由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 LPS對(duì)HMEC黏附分子及炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC以1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，加入90 μL不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，再加入10 μL LPS(終濃度為5 mg·L-1)，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，分別培養(yǎng)0、6、12、24 h取上清用于測(cè)定ICAM-1、IL-6、MCP-1，上述各指標(biāo)的測(cè)定均按照說明書進(jìn)行。

2.3 黃芩苷對(duì)LPS刺激HMEC表達(dá)黏附分子及炎癥介質(zhì)的影響

2.3.1黃芩苷樣品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取適量的黃芩苷，用DMSO完全溶解，配制成0.1 mol·L-1的溶液，分裝，于-80 ℃保存，臨用前化凍后用無(wú)血清培養(yǎng)基按10倍逐級(jí)稀釋至1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8mol·L-1。

2.3.2黃芩苷對(duì)LPS刺激HMEC表達(dá)MCP-1、ICAM-1、IL-6的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC以1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，分別加入含不同濃度(基于前期篩選，黃芩苷的終濃度分別為1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8mol·L-1)黃芩苷的RPMI-1640培養(yǎng)基90 μL預(yù)處理細(xì)胞3 h，再加入10 μL LPS(終濃度為5 mg·L-1)，37 ℃培養(yǎng)12 h取培養(yǎng)上清進(jìn)行MCP-1檢測(cè)，培養(yǎng)24 h取培養(yǎng)上清進(jìn)行ICAM-1、IL-6檢測(cè)，同時(shí)分別設(shè)置模型組、正常對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組PDTC(1.0×10-5mol·L-1)

2.4 Ca2+內(nèi)流的檢測(cè)

2.4.1熒光觀察Ca2+內(nèi)流 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC以1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后各組(組別設(shè)置同“2.3.2”)參照“2.3.2”進(jìn)行相應(yīng)處理，加入LPS刺激1 h，PBS洗3次，加入Ca2+熒光探針Fluo-4 AM于37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，于37 ℃繼續(xù)孵育20 min，用熒光顯微鏡觀察Ca2+內(nèi)流變化。

2.4.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)鈣離子內(nèi)流 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC以2×104個(gè)/孔接種于48孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后各組參照“2.3.2”進(jìn)行相應(yīng)處理(組別設(shè)置同“2.3.2”)，加入LPS刺激1 h，PBS洗1次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗3次，加入鈣離子熒光探針Fluo-4 AM于37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，于37 ℃繼續(xù)孵育20 min，然后加入PBS將細(xì)胞混勻成細(xì)胞懸液，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，結(jié)果用相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

2.5 NF-κB p65入核的檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC按1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后各組參照“2.3.2”進(jìn)行相應(yīng)處理，同時(shí)分別設(shè)置模型組、正常對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組(PDTC，終濃度為1.0×10-5mol·L-1)、陽(yáng)性對(duì)照組(TNF-α，終濃度為100 μg·L-1)，加入LPS刺激3 h，采用免疫熒光法檢測(cè)NF-κB p65入核，操作按照NF-kB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)試劑盒說明書進(jìn)行，入核信號(hào)強(qiáng)度用內(nèi)源性p65的細(xì)胞核熒光強(qiáng)度/細(xì)胞漿熒光強(qiáng)度(nuc/cyt fluorescence intensity)來計(jì)算，熒光強(qiáng)度采用Cellinsight Cx5軟件進(jìn)行分析。共進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)組別分別設(shè)置2個(gè)平行孔，每孔隨機(jī)選取9個(gè)視野進(jìn)行拍攝和數(shù)據(jù)分析。

2.6 NF-kB轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)

2.6.1質(zhì)粒制備 質(zhì)粒的制備及濃度檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[8]。

2.6.2雙熒光素報(bào)告基因檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC以1×104個(gè)/孔接種于不透光的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，棄去上清，換液，加入90 μL含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染16 h后棄上清，各組參照“2.3.2”進(jìn)行相應(yīng)處理，組別設(shè)置同2.3.2，加入LPS刺激6 h后進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測(cè)。具體方法和計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[8]。

2.7Western blot檢測(cè)NF-κB p65、p-NF-κB p65及TLR4的表達(dá) 將HMEC按1×106個(gè)/瓶接種，培養(yǎng)24 h后各組(組別設(shè)置同“2.3.2”，其中黃芩苷的終濃度為1.0×10-6mol·L-1)參照“2.3.2”進(jìn)行相應(yīng)處理，加入LPS分別刺激6 h、24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS進(jìn)行沖洗，刮下細(xì)胞進(jìn)行離心，按照蛋白抽提試劑盒進(jìn)行蛋白抽提，BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光和顯影并進(jìn)行量化分析。

3 結(jié)果

3.1 LPS對(duì)HMEC黏附分子及炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響

3.1.1LPS對(duì)HMEC表達(dá)黏附分子ICAM-1的影響 LPS刺激HMEC后ICAM-1的表達(dá)在12 h出現(xiàn)上調(diào)(Fig 1)，在24 h與對(duì)照組的差異有顯著性(P<0.01)。

Fig 1 Expression of ICAM-1 after HMEC **P<0.01 vs control

3.1.2LPS對(duì)HMEC表達(dá)炎癥介質(zhì)的影響 LPS刺激HMEC后，IL-6、MCP-1在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均有不同程度的增加(Fig 2)，其中，IL-6的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，在12 h、24 h與對(duì)照組的差異有顯著性(P<0.01)。MCP-1的表達(dá)也呈上調(diào)趨勢(shì)，在12 h達(dá)到峰值。

3.2 黃芩苷對(duì)HMEC黏附分子及炎癥介質(zhì)表達(dá)變化的影響

3.2.1黃芩苷對(duì)LPS刺激HMEC表達(dá)ICAM-1的影響 黃芩苷對(duì)LPS刺激HMEC表達(dá)ICAM-1具有干預(yù)作用(Fig 3)，且抑制作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

Fig 2 Expression of IL-6 and MCP-1 after HMEC exposure to A:IL-6;B:MCP-1.**P<0.01 vs control

Fig 3 Effect of baicalin on expression of ICAM-1 after HMEC exposure to **P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

3.2.2黃芩苷對(duì)LPS刺激HMEC表達(dá)炎癥介質(zhì)的影響 黃芩苷對(duì)LPS刺激HMEC表達(dá)IL-6、MCP-1具有干預(yù)作用(Fig 4)，且作用具有量效關(guān)系，其中中高劑量組與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 4 Effect of baicalin on expression of IL-6 and MCP-1 after HMEC exposure to A:IL-6;B:MCP-1.**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

3.3 黃芩苷對(duì)Ca2+內(nèi)流的影響HMEC受LPS刺激后，發(fā)生了明顯的Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+與Fluo-4結(jié)合后產(chǎn)生綠色熒光，黃芩苷對(duì)Ca2+內(nèi)流有抑制作用(Fig 5)。采用流式細(xì)胞儀定量測(cè)定結(jié)果表明，模型組的Ca2+內(nèi)流與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。3個(gè)濃度的黃芩苷對(duì)Ca2+內(nèi)流均有抑制作用(Fig 6)，其中高濃度組與模型組相比，差異有顯著性(P<0.05)。

3.4 黃芩苷對(duì)NF-κB p65入核的影響HMEC受到刺激后，其核內(nèi)熒光強(qiáng)度增加(Fig 7)，模型組細(xì)胞核熒光強(qiáng)度/細(xì)胞質(zhì)熒光強(qiáng)度(nuc/cyt fluorescence intensity)比值高于對(duì)照組(Fig 8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組黃芩苷的熒光強(qiáng)度比值降低，與模型組相比，差異有顯著性(P<0.05)。

3.5 黃芩苷對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)錄活性的影響LPS刺激HMEC后，NF-κB p65核轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)(Fig 9)，而黃芩苷對(duì)LPS所致的核轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)有干預(yù)作用，結(jié)果呈現(xiàn)量效關(guān)系，其中高劑量組與模型組的差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 5 Effect of baicalin on influx of calcium observed by fluorescence after HMEC exposure to LPS(×100)A:Control group;B:Model group;C:PDTC group;D:Baicalin high dose group;E:Baicalin middle dose group;F:Baicalin low dose group

Fig 6 Effect of baicalin on relative fluorescence intensity of influx of calcium ion measured by flow cytometry after HMEC exposure to *P<0.05 vs control;#P<0.05 vs model

3.6 黃芩苷對(duì)蛋白NF-κB p65、p-NF-κB及TLR4表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，p-NF-κB p65、TLR4及NF-κB p65的表達(dá)均上調(diào)(Fig 10)，其中模型組p-NF-κB p65、TLR4的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。而采用高劑量的黃芩苷干預(yù)后，p-NF-κB p65、TLR4及NF-κB p65的表達(dá)明顯下調(diào)，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

Fig 7 Effect of baicalin on the nuclear translocation of NF-κB p65 after HMEC exposure to LPS(×200，n=3)nuclei with DAPI staining,blue;NF-κB p65 with Cy3 staining,red

Fig 8 Effect of baicalin on nuc/cyt fluorescence intensity of NF-κB p65 after HMEC exposure to *P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs model

Fig 9 Effect of baicalin on transcriptional activity of NF-κB p65 after HMEC exposure to *P<0.05 vs control;#P<0.05 vs model

Fig 10 Effect of baicalin on expression of p-NF-κB p65,TLR4 and NF-κB p65 after HMEC exposure to *P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

4 討論

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的正常結(jié)構(gòu)成分，在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下，大量LPS釋放入血，從而啟動(dòng)炎癥和損傷[9]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)，TLR4被激活，進(jìn)而通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活內(nèi)皮細(xì)胞，合成和釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，從而引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[10]，這與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，故對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的抑制成為近年來心腦血管疾病防治的熱點(diǎn)。中藥黃芩是我國(guó)的大宗中藥材，主要具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血等功效[11]。黃芩苷是黃芩中的主要活性成分，近年來研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的藥理特性，如抗炎[5-7,12]、抗腫瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒等[4]。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和挖掘黃芩苷的藥理活性，本研究著眼于LPS誘導(dǎo)的早期炎癥反應(yīng)啟動(dòng)階段的干預(yù)，采用微血管內(nèi)皮細(xì)胞開展黃芩苷對(duì)炎癥反應(yīng)的干預(yù)研究。

在本研究中，LPS刺激HMEC后，發(fā)生了明顯的炎癥反應(yīng)。Ca2+發(fā)生明顯內(nèi)流，NF-κB通路活化，NF-κB p65磷酸化，NF-κB p65入核，核轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，黏附分子ICAM-1及炎癥介質(zhì)IL-6、MCP-1的表達(dá)均上調(diào)，蛋白NF-κB p65、p-NF-κB p65及TLR4的表達(dá)上調(diào)。在給予黃芩苷預(yù)處理后，Ca2+內(nèi)流、NF-κB p65入核受到抑制，黏附分子、炎癥介質(zhì)的表達(dá)，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性，TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)均下調(diào)，此結(jié)果表明黃芩苷能抑制LPS誘導(dǎo)的HMEC炎癥反應(yīng)。NF-κB是炎癥中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下由P50 /P65 /IKB三聚體組成而處于非活化狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到脂多糖刺激后，LPS首先通過結(jié)合TLRs，從而在機(jī)體內(nèi)被先天免疫系統(tǒng)識(shí)別，激活TLR4-MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而活化NF-κB誘導(dǎo)激酶形成活化的IKKs復(fù)合體，使IKB發(fā)生磷酸化、泛素化及相關(guān)蛋白酶的水解，激活NF-κB信號(hào)通路，NF-κB p65轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，從而誘導(dǎo)炎癥因子的活化表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。Ca2+作為介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)反應(yīng)的第二信使，在維持細(xì)胞正常生理功能方面具有重要作用，此外，Ca2+穩(wěn)態(tài)在維持細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)控凋亡中發(fā)揮極其重要的作用[14-15]。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞外的Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜上的鈣通道流入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+超載，從而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本工作提示黃芩苷對(duì)LPS引起的HMEC炎癥反應(yīng)作用的機(jī)制涉及到炎癥相關(guān)信號(hào)通路及Ca2+內(nèi)流的變化?；邳S芩苷通過抑制NF-κB p65磷酸化、NF-κB p65入核及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性，從而降低后續(xù)相關(guān)炎癥分子及蛋白的表達(dá)，這一系列事件具有時(shí)間上的邏輯關(guān)系，提示黃芩苷是通過抑制NF-κB p65的磷酸化或更早階段的干預(yù)發(fā)揮保護(hù)作用；而在LPS刺激HMEC后1 h檢測(cè)到明顯的Ca2+內(nèi)流，Ca2+內(nèi)流與NF-κB信號(hào)通路活化這二者之間是否存在相互影響或調(diào)控的關(guān)系，仍待進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究表明黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥具有保護(hù)作用，其機(jī)制涉及到Ca2+內(nèi)流和NF-κB信號(hào)通路的活化。進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制，將有助于認(rèn)識(shí)和挖掘黃芩苷的藥理活性，為臨床應(yīng)用及相關(guān)新藥的研究提供參考依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與生物活性研究中心實(shí)驗(yàn)室完成，在此感謝課題組全體成員的支持和幫助。)