吳華勛，陳曉蕓，劉 琪，張巧琳，黃 磊，周彤彤，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所,抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren Syndrome，pSS)發(fā)病累及唾液腺、淚腺等外分泌腺，臨床表現(xiàn)為口干、眼干[1]，并伴隨大量自身抗體產(chǎn)生，如抗SSA和SSB抗體等，以及高丙球蛋白血癥[2]。pSS患者男女比例約為1 ∶9。

pSS的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能與基因、感染等因素有關(guān)。感染因素中EB病毒、Coxsackie病毒等與pSS的發(fā)病緊密相連[3]。病毒的感染激活樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌IFNα，發(fā)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)[4]。唾液腺上皮細(xì)胞(salivary gland epithelial cells，SGECs)在IFNα或病毒的直接刺激下，分泌趨化因子如CXCL13，募集和活化淋巴細(xì)胞，使外分泌腺體發(fā)生淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。JAK1-STAT1/2信號(hào)通路的激活可能與IFNα或病毒的直接刺激下趨化因子CXCL13的產(chǎn)生有關(guān)。

目前臨床上尚無療效明確的醫(yī)治pSS的藥物。研究顯示，白芍總苷(TGP)具備抗炎免疫調(diào)節(jié)效果，已廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、pSS等多種自身免疫病[5]，但起效慢，作用較弱。課題組通過對(duì)TGP主要成分芍藥苷(Pae)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，獲得了酯化產(chǎn)物苯磺酸芍藥苷(代號(hào)CP-25)，其生物利用度及抗炎免疫藥理作用明顯上升[6]。在關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，CP-25通過調(diào)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的功能發(fā)揮其治療作用[7-8]。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase，GRK)經(jīng)磷酸化配體激活的G蛋白偶聯(lián)受體，使β-arrestin與之聚合，進(jìn)而阻止G蛋白與受體偶聯(lián)，產(chǎn)生受體“脫敏”[9]。課題組研究發(fā)現(xiàn)，CP-25對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的治療作用與其調(diào)節(jié)GRKs的活性相關(guān)[10]。實(shí)驗(yàn)性干燥綜合征(experimental Sj?gren's Syndrome，ESS)小鼠經(jīng)CP-25治療后病癥有所改善[11-12]，CP-25作用的發(fā)揮是否與其調(diào)節(jié)GRK2與JAK1的結(jié)合，進(jìn)而抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信號(hào)通路減少淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)？目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6小鼠，采用頜下腺蛋白建立了抗原誘導(dǎo)ESS模型，確立CP-25對(duì)ESS小鼠模型的作用，探討其作用機(jī)制是否通過調(diào)節(jié)GRK2與JAK1的結(jié)合，抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信號(hào)通路而發(fā)揮作用，為以后探索CP-25的藥物機(jī)制具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物:購自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)碼:SCXK(皖)2011-002。為SPF級(jí)、體質(zhì)量約為18 g，♀ C57 BL/6小鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人類頜下腺上皮細(xì)胞(human salivary gland epithelial cells，HSGECs)，購于European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC)。

1.3 藥品與試劑CP-25由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所提供，硫酸羥氯喹(150902)自上海中西制藥有限公司購買；戊巴比妥鈉(69020100)、毛果蕓香堿(PHR1494)購自美國Sigma公司；重組人IFN-α(NBP2-26651)、CXCL13抗體(NBP2-16041)購自Novus Biologicals公司；JAK1抗體(3344)、Phospho-JAK1抗體(3331)、Phospho-STAT1抗體(9167)、Phospho-STAT2抗體(4441)購自CST公司；STAT1抗體(sc-464)、STAT2抗體(sc-514193)、GRK2抗體(sc-13143)購自美國Santa Cruz公司。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司；一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國GE公司。

2 方法

2.1 ESS小鼠模型的建立、分組及給藥無菌取出C57BL/6小鼠雙側(cè)頜下腺，稱重，冰上勻漿器中研磨，勻漿放入管中，4 ℃離心(3 000 r，15 min)，BCA定量至5 g·L-1，等量弗氏完全佐劑乳化至2.5 g·L-1。d 0將上述乳化后的抗原皮內(nèi)多點(diǎn)注射至小鼠背部和尾根部，d 7再次注射。d 14將頜下腺抗原在等量弗氏不完全佐劑中乳化至2.5 g·L-1，注射加強(qiáng)免疫。

根據(jù)唾液流量，第6周剔除未成模小鼠，將小鼠分為:正常組、模型組、濃度為35、70 mg·kg-1的CP-25組和濃度為80 mg·kg-1的羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)組。給藥組于第7周開始連續(xù)2周的灌胃給藥，同體積的0.5% CMC-Na給予正常組和ESS組。第9周處死小鼠。

2.2 小鼠唾液流率的檢測(cè)小鼠的唾液量在造模后第6、7、8、9周進(jìn)行測(cè)定。小鼠經(jīng)2.4%戊巴比妥鈉麻醉后，將濃度為0.125 g·L-1的毛果蕓香堿腹腔注射，5 min后將已稱重的無菌棉球置于小鼠舌下，收集10 min，稱量后計(jì)算差值。

2.3 小鼠頜下腺HE檢測(cè)取頜下腺制作病理切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，脫水、烘干后，鏡下觀察結(jié)果，拍照。

2.4 免疫組化法測(cè)定小鼠頜下腺CXCL-13水平小鼠頜下腺切片，經(jīng)脫蠟沖洗后，將一抗CXCL-13(1 ∶100)滴至切片組織上，4 ℃ 孵育過夜，沖洗后滴加反應(yīng)增強(qiáng)液孵育30 min，沖洗后加入適量DAB顯色液，脫水晾干后封片。鏡下觀察結(jié)果，拍照。

2.5 免疫印跡法測(cè)定小鼠頜下腺中JAK1-STAT1/2通路的表達(dá)取出小鼠頜下腺，稱重，加細(xì)胞裂解液，4 ℃冰上勻漿，BCA定量后，加入Loading Buffer煮樣；配膠、灌膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗(JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2，約以1 ∶1 000比例配置)；孵育二抗，于37 ℃恒溫?fù)u床中孵育2 h；顯影液涂在PVDF膜上，使用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。ImageJ軟件條帶解析。

2.6 免疫熒光法測(cè)定HSGECs中CP-25對(duì)GRK2與JAK1共表達(dá)的作用培養(yǎng)HSGECs細(xì)胞，傳代時(shí)培養(yǎng)皿內(nèi)放入無菌蓋玻片，待HSGECs爬片后，IFN-α(10 μg·L-1)刺激48 h后；取出蓋玻片，固定、清洗，細(xì)胞通透使用0.5% Triton-100，BSA進(jìn)行封閉，加一抗(JAK1，GRK2)孵育；清洗后滴加兩種對(duì)應(yīng)的熒光二抗，避光孵育；DAPI染色后加入防熒光淬滅劑進(jìn)行封片；鏡下拍照并對(duì)共表達(dá)進(jìn)行分析。

2.7 CO-IP檢測(cè)HSGECs中CP-25對(duì)GRK2與JAK1相互作用的影響將HSGECs接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分為對(duì)照組、濃度為10 μg·L-1的IFNα組、濃度為10-5mol·L-1的IFNα+CP-25組，培養(yǎng)48 h，洗滌細(xì)胞，加入裂解液(RIPA ∶PMSF=1 ∶99)置于冰上裂解，4 ℃離心取上清；部分作為input后，準(zhǔn)備Protein A agarose(1個(gè)樣品+20 μL珠子)，清洗珠子后留取液體，加入12 μL抗體(1個(gè)樣品+4 μL抗體)，4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻；離心，將樣品與beads 結(jié)合置于4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻器中過夜；離心，棄上清，將32 μL裂解液和8 μL電泳上樣緩沖液加入樣品中，煮沸，后續(xù)操作同WB。

3 結(jié)果

3.1 CP-25對(duì)ESS小鼠唾液量的影響造模后第7周，ESS模型組小鼠的唾液流率較正常組明顯降低。給藥1周，CP-25(70 mg·kg-1)組小鼠唾液流率較ESS小鼠明顯增加；給藥2周，劑量為35，70 mg·kg-1的CP-25組和劑量為80 mg·kg-1的HCQ組小鼠唾液流率明顯增多。

3.2 CP-25對(duì)ESS小鼠頜下腺病理的影響ESS小鼠頜下腺中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較正常組嚴(yán)重，聚集成灶，唾液腺的小葉結(jié)構(gòu)消失，局部小血管因炎癥擴(kuò)張充血。與ESS模型組相比，濃度為70 mg·kg-1的CP-25和濃度為80 mg·kg-1的HCQ組中的頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。

Fig 1 Effects of CP-25 on saliva flow in ESS n=8)**P<0.01 vs normal;#P<0.05 vs model

3.3 CP-25對(duì)ESS小鼠頜下腺CXCL-13表達(dá)的影響通過IHC測(cè)定小鼠頜下腺CXCL-13的水平，ESS小鼠頜下腺中CXCL13的水平較正常組明顯升高，可能與頜下腺上皮細(xì)胞表達(dá)相關(guān)。濃度為35，70 mg·kg-1的CP-25組較ESS組可明顯降低小鼠頜下腺中CXCL13的表達(dá)。

3.4 CP-25對(duì)ESS小鼠頜下腺JAK1-STAT1/2信號(hào)通路的影響CP-25對(duì)小鼠頜下腺中JAK1-STAT1/2的變化用WB檢測(cè)。ESS小鼠頜下腺中p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2水平較正常組比明顯升高，提示ESS小鼠頜下腺JAK1-STAT1/2信號(hào)通路被激活。CP-25(70 mg·kg-1)和HCQ(80 mg·kg-1)組可明顯降低p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2蛋白的表達(dá)，提示CP-25可抑制ESS模型小鼠頜下腺JAK1-STAT1/2通路的激活。

3.5 CP-25促進(jìn)GRK2與JAK1的結(jié)合采用激光共聚焦檢測(cè)GRK2與JAK1共表達(dá)情況，結(jié)果顯示，GRK2與JAK1在HSGECs中均有表達(dá)，多存在于胞質(zhì)，其次是胞膜。與正常對(duì)照組相比，IFN-α刺激后，GRK2與JAK1共表達(dá)下降，CP-25(10-5mol·L-1)能提高GRK2與JAK1的共表達(dá)。CO-IP結(jié)果與免疫熒光相似，IFN-α刺激后，GRK2與JAK1相互結(jié)合作用減弱，CP-25(10-5mol·L-1)能提高GRK2與JAK1的結(jié)合。

4 討論

pSS是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫病，外分泌腺易產(chǎn)生灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。唾液流率及唇腺活檢是確診pSS的重要方法。在本實(shí)驗(yàn)中，ESS小鼠采用頜下腺抗原誘導(dǎo)SS模型，唾液流率明顯減少，頜下腺病理中出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，聚集成灶，證明模型誘導(dǎo)成功。ESS小鼠的唾液流率經(jīng)CP-25治療后明顯增加，頜下腺病理也得到改善。

對(duì)pSS患者唇檢時(shí)，多數(shù)患者產(chǎn)生異位生發(fā)中心(EGC)，這類患者淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，與B淋巴細(xì)胞異常表達(dá)有關(guān)。B淋巴細(xì)胞參與pSS的發(fā)病表現(xiàn)在:遷移、聚集在炎性組織中造成EGC、B淋巴細(xì)胞亞群分布異常、分泌多種自身抗體等[13]。淋巴浸潤(rùn)灶的形成有多種趨化因子和炎癥因子的參與，其中使B淋巴細(xì)胞發(fā)生遷移和聚集的趨化因子主要有CXCL13[14]，由樹突細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌，是目前所知獨(dú)有的可與CXCR5受體結(jié)合的配體。在淋巴浸潤(rùn)灶及EGC中，CXCL-13表達(dá)的異常加快了疾病的發(fā)生[15]。在NOD/LtJ小鼠SS模型中，采用抗CXCL-13抗體治療，可通過抑制B淋巴細(xì)胞在唾液腺組織的浸潤(rùn)，使唾液腺炎癥反應(yīng)降低[16]。CXCL-13在pSS中明顯升高，可反映疾病的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)中ESS小鼠頜下腺中CXCL-13的蛋白水平明顯升高，CP-25可明顯降低其表達(dá)。CXCL-13的表達(dá)還可能與SGECs分泌有關(guān)。

Fig 2 Effects of CP-25 on pathological of salivary gland in ESS miceA:Normal;B:Model;C:CP-25(35 mg·kg-1);D:CP-25(70 mg·kg-1);E:HCQ(80 mg·kg-1)

Fig 3 Effects of CP-25 on CXCL13 expression in salivary gland in ESS miceA:Normal;B:Model;C:CP-25(35 mg·kg-1);D:CP-25(70 mg·kg-1);E:HCQ(80 mg·kg-1)

Fig 4 Effects of CP-25 on JAK-STAT1/2 expression in salivary gland in ESS mice n=3)1:Normal;2:Model;3:CP-25(35 mg·kg-1);4:CP-25(70 mg·kg-1);5:HCQ(80 mg·kg-1);**P<0.01 vs normal;#P<0.05 vs model

Fig 5 Effects of CP-25 on co-expression of GRK2 and JAK1*P<0.01 vs normal;#P<0.05 vs model.A.The effects of CP-25 on the co-expression of GRK2 and JAK1 by immunofluorescence;B.The effects of CP-25 on the combination of GRK2 and JAK1 by CO-IP n=3)

SGECs可表達(dá)多種共刺激分子、粘附分子及B 細(xì)胞活化分子具有抗原提呈作用。SGECs不僅是異常免疫反應(yīng)的靶細(xì)胞，在IFNα和病毒的刺激下可分泌BAFF、IL-6、CXCL12和CXCL13等，促進(jìn)B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、DC 細(xì)胞的聚集[17]。因此，SGECs作為效應(yīng)細(xì)胞啟動(dòng)和維持了免疫反應(yīng)。在pSS的發(fā)病機(jī)制中，由細(xì)菌、病毒、RNA等引發(fā)IFN的大量產(chǎn)生，進(jìn)而引起免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的異常改變?cè)絹碓绞艿疥P(guān)注。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能由IFNs經(jīng)過JAK-STAT激活，產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子及趨化因子如CXCL-13，JAK/STAT信號(hào)級(jí)聯(lián)可能是IFN發(fā)揮作用的關(guān)鍵途徑[18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ESS模型小鼠頜下腺中p-JAK1、p-STAT1和p-STAT2表達(dá)明顯升高，JAK1-STAT1/2激活；CP-25可明顯抑制JAK1-STAT1/2信號(hào)的活化，可能進(jìn)而降低了CXCL-13的表達(dá)。

目前臨床上治療pSS尚無理想藥物。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，TGP治療pSS有明確療效，但起效較慢。CP-25對(duì)NOD/LtJ小鼠自發(fā)型、C57BL/6小鼠抗原誘導(dǎo)型干燥綜合征模型均具有明顯的治療作用[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中，CP-25可能通過抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信號(hào)活化而降低B淋巴細(xì)胞的遷移，發(fā)揮對(duì)抗原誘導(dǎo)型ESS模型小鼠的治療作用，CP-25作用的靶蛋白GRK2是否對(duì)JAK1有直接作用呢？本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光共定位及CO-IP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GRK2與JAK1在HSGECs中均有表達(dá)，IFNα刺激后，GRK2與JAK1共表達(dá)下降，CP-25(10-5mol·L-1)能提高GRK2與JAK1的共表達(dá)。CO-IP結(jié)果與免疫熒光相似，IFN-α刺激后，GRK2與JAK1相互結(jié)合作用減弱，CP-25(10-5mol·L-1)能提高GRK2與JAK1的結(jié)合。

根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，CP-25可能通過抑制GRK2的轉(zhuǎn)膜，而恢復(fù)胞質(zhì)內(nèi)GRK2與JAK1的結(jié)合，進(jìn)而抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信號(hào)的活化，降低B淋巴細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)，改善頜下腺淋巴浸潤(rùn)灶，提高唾液流率，發(fā)揮對(duì)ESS小鼠的治療作用。本課題為研究CP-25治療ESS的作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為今后CP-25的臨床使用提供了理論依據(jù)。