婁 毅 ,叢艷飛 ,丁晶晶 ,李 芳 ,王莉莉

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心，遼寧 本溪 117000)

中國是世界上最大的煙草生產(chǎn)和消費國，2002 年中國女性居民主動吸煙率為3.1%，被動吸煙率高達54.6%[1]。煙草煙霧(cigarette smoke，CS)中含有多環(huán)芳香烴(PAHs)、苯并芘(BaP)、尼古丁、生物堿和重金屬等 4 000 多種有害化學(xué)物質(zhì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙會使處于育齡期的女性生育力下降[3]，口服尼古丁會導(dǎo)致大鼠子宮腔上皮和腺上皮形態(tài)學(xué)改變[4]，CS 暴露可導(dǎo)致子宮 MMP-9、CXCR4和ER的表達增加[5]。我們前期的研究表明，CS暴露通過激活組蛋白脫乙?；?/2(histone deacetylase，HDAC)，導(dǎo)致小鼠子宮肌層和子宮內(nèi)膜變薄，腺體組織和間質(zhì)細胞明顯減少等組織形態(tài)學(xué)改變，TSA，HDAC的通用抑制劑，通過抑制 HDAC 1/2 和 mTOR 的激活，重新激活自噬，改善CS暴露引起的小鼠子宮組織形態(tài)學(xué)改變[6]。此外，我們還發(fā)現(xiàn) P2RX7介導(dǎo)的細胞焦亡和凋亡參與了 TSA 緩解的CS 暴露所致的小鼠子宮損傷過程[7]。因此，進一步探究煙草煙霧暴露對女性生育能力影響的相關(guān)分子機制將為提高女性生育健康做出一定貢獻。

環(huán)境毒素可以通過表觀遺傳學(xué)機制影響基因表達水平，進而影響個體的表型或者疾病的易感性[8]。表觀遺傳學(xué)修飾包括翻譯后的組蛋白修飾，如組蛋白的乙?；图谆揎?、DNA的甲基化修飾等，表觀遺傳修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[9-10]。組蛋白修飾水平變化和相關(guān)組蛋白修飾轉(zhuǎn)移酶的變化和很多子宮疾病有關(guān)[11-14]。在子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜組織中發(fā)現(xiàn)全組蛋白 H3K4 和 H3K9 的低甲基化，說明組蛋白修飾異常在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[11]。子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜中 H3K27me3 陽性細胞百分比明顯低于正常分泌型子宮內(nèi)膜。此外，H3K27me3 的甲基轉(zhuǎn)移酶 EZH2 在子宮內(nèi)膜異位癥上皮細胞中高水平表達。提示 H3K27me3 在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用和 EZH2 可能作為該疾病的潛在治療靶點[12]。以上結(jié)果表明，組蛋白修飾和相關(guān)轉(zhuǎn)移酶的異常參與很多子宮疾病的發(fā)生發(fā)展，但組蛋白修飾和相關(guān)轉(zhuǎn)移酶的變化是否參與了煙草煙霧暴露對子宮的毒理作用和 TSA 的緩解過程，目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 60 日齡C57BL/6 ♀小鼠 36 只，體質(zhì)量(20.0±0.5)g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，SCXK(遼)2015-0001。實驗動物飼養(yǎng)在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物中心 SPF 級動物飼養(yǎng)室，SYXK(遼)2017-0004，室溫(22 ±3)℃，相對濕度(50±20)%。針對實驗動物的所有操作流程關(guān)注動物福利，并通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(2013PS06K；2019PS263K)。

1.1.2試劑 雄獅牌香煙(每支含 0.7 mg 尼古丁和 8 mg 焦油)；組蛋白提取試劑盒(EPIGENTEK，批號：#OP-0006)；TSA(Sigma；批號：T1952)；免疫組化試劑盒(邁新，批號：KIT9921)；一抗來源：GAPDH(康成生物；批號：KC-5G4，規(guī)格：100 μL)；H3(ABclonal；批號：A2348)；H3K4me1(ABclonal；批號：A2355)；H3K4me2(ABclonal；批號：A2356)；H3K4me3(ABclonal；批號：A2357)；H3K9me1(ABclonal；批號：A2358)；H3K9me2(ABclonal；批號：A2359)；H3K9me3(ABclonal；批號：A2360)；H3K27me3(ACTIVEMOTIF；批號：61017)；GLP(R&D；批號：PP-B0422)；G9ɑ(MILLIPORE；批號：#09-071)；EZH2(CST；批號：5246S)；羊抗兔二抗(Abbkine；批號：A23620)；羊抗鼠二抗(Abbkine；批號：A25012)。

1.1.3實驗儀器 Western blot垂直電泳系統(tǒng)(美國Hoffer公司)；Western blot轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；RM2235石蠟切片機(德國Leica公司)；組織石蠟包埋機(湖北孝感闊海醫(yī)療公司)；低溫高速離心機(美國Thermo公司)；-80 ℃ 超低溫冰箱(美國Thermo公司)；電子天平(美國G&G公司)QS-RO型全自動超純水機(沈陽惠思純水設(shè)備有限公司)；生物凈化工作臺(中國蘇凈安泰公司)；眼科剪刀、鑷子等必備手術(shù)器械(江蘇寵寶集團醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1煙草煙霧暴露小鼠模型 將36只C57 BL/6 ♀小鼠按隨機分組的方法分為對照組、CS 暴露組和 CS+TSA 組，每組 12 只，對每組內(nèi)的小鼠進行編號，列表記錄它們的初始體質(zhì)量及狀態(tài)。自制實驗性 CS 暴露裝置，CS 暴露方法參照本課題組前期實驗[6-7]。CS 暴露組和 CS+TSA 組小鼠 CS 暴露時間為30 d，每天兩次 CS 暴露，每次 CS 暴露給兩支煙持續(xù)暴露 2 h，CS 暴露時間間隔為5 h。對照組小鼠吸入空氣。藥物 TSA(將 TSA 溶于DMSO，再用生理鹽水將其配制成濃度為 1.98×10-5mol·L-1的溶液)，按0.6 μg·g-1體質(zhì)量的劑量，每2 d 1次，腹腔內(nèi)注射給 CS+TSA 組小鼠。CS暴露30 d后，對處于發(fā)情期的雌性小鼠實施安樂死，并從每組中至少收集 5 個子宮組織用于進一步研究。

1.2.2HE 染色 各組小鼠的子宮組織用 4% 多聚甲醛固定 24 h，再經(jīng)梯度酒精的洗滌與脫水以及二甲苯透明，浸在石蠟中進行組織包埋，以 4 μm 厚度連續(xù)切片，然后進行標準 HE 染色，中性樹脂封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3Western blot 提取各組小鼠子宮組織總蛋白和組蛋白，具體操作步驟參照試劑盒說明書。然后將提取的各組子宮組織的蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，分別用 GAPDH(1 ∶10 000)；H3(1 ∶1 000)；H3K4me1(1 ∶200)；H3K4me2(1 ∶200)；H3K4me3(1 ∶200)；H3K9me1(1 ∶200)；H3K9me2(1 ∶200)；H3K9me3(1 ∶200)；H3K27me3(1 ∶300)；GLP(1 ∶400)；G9ɑ(1 ∶400)和 EZH2(1 ∶200)抗體孵育。實驗結(jié)束后用 Image-J 軟件對光密度值進行定量檢測，對不同分子量蛋白的表達情況進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用 GraphPad Prism 7.00 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TSA 抑制 CS 暴露導(dǎo)致的子宮組織結(jié)構(gòu)改變CS 暴露后小鼠的子宮濕重降低，子宮肌層變薄、腺體和間質(zhì)細胞數(shù)目減少，TSA 可以有效抑制 CS 暴露引起的小鼠子宮的上述形態(tài)學(xué)改變(見Fig 1)。以上 CS 暴露導(dǎo)致的子宮組織結(jié)構(gòu)改變和TSA 對子宮損傷的改善和我們先前的研究結(jié)果一致[6]。

Fig 1 TSA relieved changes in uterine tissue morphology caused by CS exposureHE staining was used to observe the morphology of mouse uterus in the control group,CS exposed group and CS exposed+TSA group)

2.2 TSA 抑制 CS 暴露誘導(dǎo)的小鼠子宮組織組蛋白 H3K9me1 修飾水平變化采用 Western blot 技術(shù)檢測了各組(對照組、CS 暴露組和 CS+TSA 組)小鼠子宮組織組蛋白中 H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3總的修飾水平，結(jié)果表明，CS 暴露后小鼠子宮組織總 H3K9me1 表達水平明顯升高，TSA有效抑制了 CS 暴露誘導(dǎo)的小鼠子宮組織 H3K9me1 的表達。此外，CS 暴露后小鼠子宮組織總 H3K27me3 表達水平明顯升高，TSA進一步激活了小鼠子宮組織總 H3K27me3 表達水平。其他檢測的組蛋白總的修飾水平在各鼠子宮組織中的改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見Fig 2)。因此，結(jié)果表明 H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與煙草煙霧對小鼠子宮的損傷過程，且 H3K9me1 組蛋白修飾水平的變化在TSA 緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠子宮損傷過程中發(fā)揮重要作用。

Fig 2 Histone modifications involved in process of uterine injury alleviated by TSA in female mice induced by CS exposure (,n=3)Western blot results showed that TSA significantly inhibited global H3K9me1 modification and further aggravated H3K27me3 change induced by CS exposure.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs CS

2.3 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在小鼠子宮組織中的表達H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與 CS對小鼠子宮的損傷過程，為了探索組蛋白修飾水平改變的機制，我們進一步檢測了各組小鼠子宮組織中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 GLP(H3K9 甲基轉(zhuǎn)移酶)、G9ɑ(H3K9 甲基轉(zhuǎn)移酶)和EZH2(H3K27me3 甲基轉(zhuǎn)移酶)的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CS暴露后小鼠子宮組織 GLP 和 G9ɑ 表達水平增加，TSA抑制了 CS 暴露激活的小鼠子宮組織 GLP和G9ɑ的表達。此外，CS暴露后小鼠子宮組織中EZH2表達水平增加，應(yīng)用TSA后進一步激活了CS暴露誘導(dǎo)的EZH2表達水平(見Fig 3)。我們的研究結(jié)果表明：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(GLP、G9α、EZH2)表達水平的增加在煙草煙霧對小鼠子宮的損傷中發(fā)揮作用，GLP、G9α和TSA改善在CS暴露引起的子宮組織形態(tài)改變過程中起到一定的作用。

Fig 3 Histone methyltransferase involved in process of uterine injury alleviated by TSA in female mice induced by CS exposure (,n=3)TSA suppressed GLP and G9ɑ expression in mice uterine tissue induced by CS exposure,but further activated EZH2 increase.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs CS

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CS暴露后小鼠的子宮腺體和間質(zhì)細胞數(shù)目減少，TSA 可以有效抑制 CS 暴露引起的小鼠子宮的上述形態(tài)學(xué)改變。以上 CS 暴露導(dǎo)致的子宮組織結(jié)構(gòu)改變和 TSA 對子宮損傷的改善和我們先前的研究結(jié)果一致[7]。研究發(fā)現(xiàn) CS 中的有害物質(zhì)可以導(dǎo)致肺上皮細胞中 DNA 甲基化和組蛋白修飾發(fā)生變化[13-15]。但是，在子宮組織中 CS 暴露能否通過改變組蛋白修飾參與其對子宮的毒理作用和 TSA 的緩解過程，目前尚不清楚。為進一步探究組蛋白修飾水平變化在 CS 暴露對小鼠子宮的毒理作用以及在 TSA 對子宮損傷的改善中的作用，我們采用 Western blot 技術(shù)檢測了各組小鼠子宮組織組蛋白中H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3總的修飾水平。結(jié)果表明：H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與 CS 對小鼠子宮的損傷過程，且 H3K9me1 組蛋白修飾水平的變化在 TSA 緩解的 CS 暴露所致的小鼠子宮損傷過程中發(fā)揮重要作用。環(huán)境毒素可以通過表觀遺傳學(xué)機制影響基因表達水平。本研究發(fā)現(xiàn) G9ɑ 和 GLP 調(diào)節(jié)的總 H3K9me1 組蛋白修飾水平變化參與 CS 對小鼠子宮的損傷和 TSA 的緩解過程。但是，H3K9me1 組蛋白修飾水平變化后影響了下游哪些基因的表達，目前尚不清楚。我們前期發(fā)現(xiàn) CS 暴露能夠通過激活小鼠子宮組織中 HDAC1/2、mTOR和P2RX7介導(dǎo)的細胞焦亡導(dǎo)致子宮肌層和子宮內(nèi)膜變薄，而 TSA 可以抑制 HDAC1/2、mTOR和P2RX7的活化，緩解 CS 暴露引起的子宮組織形態(tài)改變[6-7]。CS 暴露和 TSA 處理后子宮組織中 HDAC1/2、mTOR 和 P2RX7表達水平的變化是否和 H3K9me1 組蛋白修飾水平變化有關(guān)，值得我們后續(xù)深入研究。

我們進一步檢測了各組小鼠子宮組織中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 GLP(H3K9 甲基轉(zhuǎn)移酶)、G9α(H3K9 甲基轉(zhuǎn)移酶)和EZH2(H3K27me3 甲基轉(zhuǎn)移酶)的表達水平。CS 暴露后小鼠子宮組織GLP和G9α表達水平增加，TSA抑制了CS暴露激活的小鼠子宮組織 GLP和G9α的表達。此外，CS暴露后小鼠子宮組織中EZH2表達水平增加，應(yīng)用TSA后進一步激活了CS暴露誘導(dǎo)的 EZH2表達水平。我們的研究結(jié)果表明：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(GLP、G9α、EZH2)表達水平的增加在煙草煙霧對小鼠子宮的損傷中發(fā)揮作用。此外，GLP、G9α在TSA改善CS暴露引起的子宮組織形態(tài)改變過程中起到一定的作用。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(GLP、G9α和EZH2)在子宮組織中的作用，目前很少文獻報道。G9ɑ(H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶)在子宮內(nèi)膜癌組織中表達升高，G9ɑ 通過抑制 E-cadherin 影響內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移和進展。提示 G9ɑ 調(diào)節(jié)的表觀遺傳通路可能作為子宮內(nèi)膜癌的潛在治療靶點[16]。新生兒暴露于二乙雌酚可引起小鼠子宮癌，DES可明顯降低 EZH2、組蛋白賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶2A和組蛋白去乙?；?HDAC1、HDAC2 和 HDAC3 的表達水平[17]。子宮組織中 EZH2 的表達水平和子宮的發(fā)育階段和激素水平有關(guān)，EZH2 表達缺失可導(dǎo)致異常的子宮上皮增生、子宮肥大，表明 EZH2 在子宮發(fā)育和功能中起著至關(guān)重要的作用[18]。本研究中發(fā)現(xiàn) CS 暴露后小鼠子宮組織組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 GLP、G9α和EZH2 表達水平增加，表明這些酶的激活和 CS 暴露對子宮組織的損傷有關(guān)。提示GLP、G9ɑ EZH2可能作為靶向治療煙草煙霧暴露導(dǎo)致的女性生育能力受損的新的靶點。然而，TSA 進一步加劇煙草煙霧暴露激活的 EZH2 和 H3K27me3 修飾水平變化。提示：TSA對煙草煙霧暴露激活的 EZH2 和 H3K27me3 修飾水平?jīng)]有緩解作用。

綜上所述，組蛋白修飾變化參與 TSA 緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠子宮損傷過程。本研究為闡明表觀遺傳機制在煙草煙霧暴露導(dǎo)致的女性生育能力受損中提供了前期基礎(chǔ)，為未來治療吸煙引起的女性不孕提供了新的靶點和思路。