余佩靜,胡陽生,陳劉贈,石靜波,劉新華

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.第一附屬醫(yī)院藥劑科、2.國家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級實驗室、3.藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

炎癥是機(jī)體對抗傷害或感染時的一種保護(hù)性行為。但是，當(dāng)炎癥變?yōu)槁詴r，則會損害組織、引發(fā)多種疾病，例如常見的心血管疾病、自身免疫性疾病和惡性腫瘤等[1]。目前市場上的抗炎藥，不論是甾體抗炎藥，還是非甾體抗炎藥，都有諸多副作用。因此，研發(fā)新型抗炎化合物就顯得十分迫切。

吡唑并[4,3-d]嘧啶這種母核結(jié)構(gòu)與嘌呤的結(jié)構(gòu)非常相似，是其生物電子等排體[2]。因此，吡唑并[4,3-d]嘧啶類母核具有很高的研究價值，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，有望設(shè)計合成出新型先導(dǎo)化合物。

NLRP3炎癥小體的活化與很多疾病有關(guān)聯(lián)，多種小分子化合物可以憑借調(diào)控NLRP3炎癥小體的活化進(jìn)而起到治療疾病的效果[3]。例如，3,4-methylenedioxy-β-nitrostyrene小分子化合物和砷酸等物質(zhì)能夠有效抑制了NLRP3炎癥小體活化[4]；小鼠敗血癥、CAPS綜合癥和實驗性腦脊髓炎等疾病可借助小分子化合物MCC950抑制NLRP3炎癥小體活化從而起到改善作用[5]；格列本脲靶向ATP敏感的鉀離子通道選擇性抑制NLRP3炎癥小體[6]。因此，本課題組基于吡唑并[4,3-d]嘧啶的母核結(jié)構(gòu)改造出的新型小分子化合物，通過計算機(jī)分子對接，發(fā)現(xiàn)其可能具有抗炎活性。進(jìn)一步對其進(jìn)行藥理機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，該化合物是通過NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路來改善體外炎癥反應(yīng)，這可能是治療炎癥相關(guān)疾病很有前景的先導(dǎo)化合物。

1 材料

1.1 細(xì)胞與試劑RAW264.7細(xì)胞株購于北京貝納科技有限公司；一氧化氮檢測試劑盒(批號NO.S0021)購于碧云天生物技術(shù)公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(批號2019044)購于Hyclone公司；熒光定量PCR試劑盒購于TAKARA公司(批號AJ12457A)；噻唑藍(lán)(MTT，批號No EZ5679C133)購于Sigma公司；TRIzol試劑(批號No1382737)購于Invitrogen公司。

1.2 儀器細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(安泰空氣技術(shù)公司)；電泳儀、半干轉(zhuǎn)儀(美國伯樂公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱(美國杜邦公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Tek,USA)；萬分之一電子天平(美國賽豪斯公司)。

2 方法

2.1 吡唑并嘧啶衍生物的合成化合物E合成的路線：試劑和條件：(a)：1.呋喃丙烯酸，CH2Cl2，(COCl)2和二甲基甲酰胺(催化量)，25 ℃，3 h；2.CH2Cl2，三乙胺，25 ℃，2 h (b)：乙醇鈉，乙醇，回流，12 h；(c)：三氯氧磷，回流，12 h；(d)：鄰氯芐胺，異丙醇，回流。

2.2 分子對接環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2(PDB：3LN1))的晶體結(jié)構(gòu)作為分子對接的受體，并將與之結(jié)合的配體周圍的氨基酸殘基定義為對接的活性位點。通過Discovery Studio 2018中的Prepare Ligands和Full Minimization程序，將化合物轉(zhuǎn)換成正確的三維結(jié)構(gòu)并進(jìn)行能量最小化。最后進(jìn)行對接程序，將目標(biāo)化合物對接進(jìn)入COX-2的活性位點中。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞對刺激很敏感,培養(yǎng)不需要用胰酶消化，傳代的時候直接用移液槍吹打，但需注意吹打頻率。考慮到該細(xì)胞生長速度快，本研究在實驗過程中每天傳代1次。

2.4 化合物的細(xì)胞毒性實驗通過MTT實驗分析評估化合物的細(xì)胞毒性。將細(xì)胞接種在96孔板上，次日加梯度濃度的化合物。持續(xù)24 h的培養(yǎng)之后，加入噻唑藍(lán)溶液，再培養(yǎng)4 h，棄去上清后將DMSO加入。搖床上搖10 min后在酶標(biāo)儀上測OD值。

2.5 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化收集RAW264.7細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿(6 cm)中，設(shè)置正常組、炎癥模型組及加梯度濃度化合物的實驗組(5、10、20 μmol·L-1)共5個皿，每皿種約150萬細(xì)胞，加3 mL培養(yǎng)基，放在培養(yǎng)箱過夜，d 2實驗組加化合物，棄去舊培養(yǎng)基，加入新的配制好的含濃度梯度化合物的培養(yǎng)基，正常組換上3 mL新鮮培養(yǎng)基即可。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱，1 h后取出，模型組和實驗組的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，LPS的工作液濃度為1 mg·L-1。培養(yǎng)24 h后，利用顯微鏡觀察該細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

2.6 化合物對NO含量的影響將RAW264.7細(xì)胞接種在96孔板上過夜。d 2，在LPS刺激之前1 h，將梯度濃度的化合物添加到孔中。24 h后，使用一氧化氮試劑盒測量培養(yǎng)基中的NO。

2.7 Western blot 檢測蛋白表達(dá)將細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，d 2與上述相同的方式處理細(xì)胞。將細(xì)胞在270 μL RIPA中裂解。本實驗中的蛋白濃度則通過BCA試劑盒進(jìn)行測量。采用電泳分離蛋白樣品再轉(zhuǎn)到PVDF膜，封閉2 h。一抗中4 ℃下孵育過夜，d 2在對應(yīng)的二抗中孵育1 h。用TBST洗干凈膜后，涂上適量的顯影液，即可放進(jìn)顯影儀進(jìn)行顯影，拍照保存。用ImageJ軟件和GraphPad Prism7.0軟件來分析結(jié)果并作圖，實驗重復(fù)3次。

2.8 熒光定量Real-time PCR 實驗將細(xì)胞接種在6孔板中。然后將LPS添加到經(jīng)過梯度濃度化合物處理過的細(xì)胞中，用TRIzol試劑從每組中提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒相關(guān)要求，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按熒光定量PCR試劑盒要求進(jìn)行擴(kuò)增。上下游引物(正向和反向)：TNF-α：5′ TGTCCCTTTCACTCACTGGC 3′ 和5′ CATCTTTTGGGGGAGTGCCT 3′；IL-6：5′ GAGGATACCACTCCCAACAGACC 3′和5′ AAGTGCATCATCGTTGTT CATACA 3′；IL-1β：5′ TGGCAATGAGGATGACTTGT 3′和5′GTGGTGGTCGGAGATTCGTA 3′；COX-2：5′ ACCTGGTGAACTACGACTGC 3′和5′ TGGTCGGTTTGATGTTACT 3′；GAPDH：5′ GGACCTCATGGCCTACATGG 3′和5′TAGGGCCTCTCTTGCTCAGT 3′。

2.9 動物實驗C57BL/6小鼠30只，生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2017-001，♂，體質(zhì)量(20±2)g，隨機(jī)分為5組，正常組，炎癥模型組通過尾靜脈注射同體積生理鹽水，實驗組用不同劑量化合物，還設(shè)置一組只用高劑量化合物給藥。1 h后，除了正常組和只加高劑量化合物組給等體積生理鹽水外，其它各組尾靜脈注射LPS(20 mg·kg-1)來造急性肺損傷模型。48 h后處死小鼠，取肺組織，石蠟包埋切片，HE染色，在顯微鏡下觀察。

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析實驗重復(fù)至少3次。借助GraphPad Prism7.0處理數(shù)據(jù)和繪圖；并采用單因素方差分析或t檢驗比較樣本均數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 分子對接基于靶標(biāo)COX-2進(jìn)行初步分子對接，發(fā)現(xiàn)以吡唑并嘧啶結(jié)構(gòu)為基本母核的衍生物具有良好的抗炎活性，吡唑并嘧啶母核與靶標(biāo)COX-2的氨基酸殘基Val335和Ala513形成了π-σ相互作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物上的呋喃環(huán)和苯環(huán)分別進(jìn)入結(jié)合口袋的兩個部分，并和口袋內(nèi)周圍的氨基酸殘基產(chǎn)生了相互作用。這種結(jié)合模式與塞來昔布中的苯環(huán)和三氟甲基相似，具體相互作用如Fig 2所示。這些相互作用或許使得目標(biāo)化合物與靶標(biāo)COX-2穩(wěn)定結(jié)合，產(chǎn)生抗炎活性，因此，本文以該化合物進(jìn)行下一步的抗炎活性研究。

Fig 1 Synthesis route of compounds E

3.2 化合物對細(xì)胞活力的影響通過MTT法評估新型化合物的細(xì)胞毒性。將細(xì)胞與不同濃度的化合物或LPS一起孵育。如Fig 3所示，低于40 μmol·L-1的新型化合物沒有明顯的細(xì)胞毒性。

3.3 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化RAW264.7細(xì)胞正常狀態(tài)在顯微鏡下看應(yīng)該是圓圓的亮晶晶的，沒有偽足，當(dāng)受到LPS的刺激時，細(xì)胞會發(fā)生炎癥反應(yīng)，細(xì)胞明顯會發(fā)生形態(tài)學(xué)上的改變，細(xì)胞會伸出偽足，變得膨脹，細(xì)胞由圓形長出觸角，變成梭形或多邊形。如Fig 4所示實驗組C、D、E跟炎癥模型組B相比，細(xì)胞的變異程度得到了明顯的改善，隨著化合物濃度的增加，細(xì)胞變異改善的越明顯，據(jù)此可以推測出該化合物能夠緩解LPS引起的RAW264.7細(xì)胞的變異程度，而這可能由于炎癥反應(yīng)受到抑制產(chǎn)生的結(jié)果。

Fig 2 Docking result of title compound and COX-2

Fig 3 Effect of title compound on cell

Fig 4 Morphological changes of cells(×20)A：The Control group;B：LPS group;C：LPS +title compound (5 μmol·L-1);(D) LPS +title compound (10 μmol·L-1);(E) LPS +title compound (20 μmol·L-1)

3.4 化合物對NO的產(chǎn)生和COX-2表達(dá)的影響NO在炎癥中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。當(dāng)受到LPS刺激時，NO明顯增加。與LPS炎癥模型組相比，實驗組濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的NO生成，如Fig 5所示。COX-2介導(dǎo)的前列腺素的產(chǎn)生與多種炎性疾病有關(guān)，而COX-2在多種炎性疾病中過度表達(dá)。如Fig 6A和B所示，從蛋白質(zhì)和mRNA的水平來看，當(dāng)受LPS刺激時，COX-2的表達(dá)增加。與LPS炎癥模型組相比，實驗組(10，20 μmol·L-1)也抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)。

Fig 5 LPS-induced NO generatio ninhibited ##P<0.01 vs control group,**P<0.01 vs LPS-stimulated cells.

Fig 6 COX-2 protein and mRNA expression inhibited ##P<0.01 vs control group,*P<0.05,**P<0.01 vs LPS-stimulated cells.

3.5 化合物抑制TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表達(dá)TNF-α、IL-6、IL-1β都是炎癥反應(yīng)中的重要促炎因子，抑制促炎因子的產(chǎn)生可以抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。我們通過熒光定量 Real-time PCR 實驗，從mRNA的水平來看促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)的變化。如Fig 7所示，模型組的促炎因子與正常細(xì)胞組相比明顯增高，而實驗組與炎癥模型組相比，TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的水平都明顯降低，說明該化合物能夠從基因水平抑制促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。

Fig 7 Effect of title compound on gene transcription of TNF-α,IL-6 and IL-1β in RAW264.7 cells by ##P<0.01 vs control group,**P<0.01 vs LPS-stimulated cells.

3.6 化合物抑制NF-κB通路為了探討新型化合物對NF-κB通路的作用，通過Western blot實驗分析了p-p65、p65、IκB、p- IκB的蛋白表達(dá)，如Fig 8所示，與正常組相比，炎癥模型組中p65的磷酸化明顯增加。而實驗組與炎癥模型組相比，可以看出化合物抑制了IκB蛋白的磷酸化和降解。同時，當(dāng)實驗組中化合物濃度為20 μmol·L-1時，p65的磷酸化也受到了抑制。

Fig 8 LPS-induced NF-κB pathway suppressed #P<0.05,##P<0.01 vs control group,*P<0.05,**P<0.01 vs LPS-stimulated group.

3.7 化合物抑制NLRP3炎癥小體的活化炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，在炎癥類的疾病中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。由Fig 9可知，炎癥模型組與正常細(xì)胞組相比，NLRP3、ASC、caspase-1蛋白明顯增多，而給了不同濃度化合物的實驗組與炎癥模型組相比，蛋白表達(dá)量下降，說明NLRP3炎癥小體的活化受到了抑制，該化合物能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化。

Fig 9 LPS-induced activation of NLRP3 inflammasome ##P<0.01 vs control group,**P<0.01 vs LPS-stimulated group.

Fig 10 LPS-induced acute lung injury relieved by title compound(n=6)

Fig 11 NF-κB/NLRP3 inflammasome pathway inhibited by title compound

3.8 化合物對小鼠急性肺損傷的影響在小鼠體內(nèi)實驗中，實驗組與炎癥模型組，相比，實驗組LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤，肺組織充血水腫，肺泡結(jié)構(gòu)破壞都有所緩解，且20 mg·kg-1的劑量緩解效果比10 mg·kg-1的更好，初步說明該化合物有緩解小鼠實驗中LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的作用。

4 討論

炎性細(xì)胞因子是一類小分子蛋白質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性和復(fù)雜的功能[7]。當(dāng)受到LPS刺激時，促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β明顯增加[8]。在用LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中，該新型化合物可以下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA的表達(dá)量。NO作為一種氣體信號分子，在體內(nèi)通常以硝酸鹽和亞硝酸鹽的穩(wěn)定形式存在，可以調(diào)節(jié)生物體中的很多種生理和病理反應(yīng)[9]。在病理條件下,如當(dāng)機(jī)體會受到TNF-α、LPS等的刺激，就會激活炎癥反應(yīng)途徑并導(dǎo)致NO合成量增加、進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)[10]。而該化合物濃度依賴性地抑制了LPS誘導(dǎo)的NO生成。一般而言，在正常組織細(xì)胞中，COX-2活性較低，因為它只是一種誘生型酶；當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，它的表達(dá)水平可急劇增加，從而致使PGI2、PEG2和PGE1等含量的升高、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)以及組織損傷[11]。通過Western blot實驗和熒光定量Real-time PCR實驗，表明該化合物抑制了LPS誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)。

NF-κB是一類與炎癥反應(yīng)緊密聯(lián)系的轉(zhuǎn)錄因子，一般而言，它在細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)下，主要在細(xì)胞質(zhì)中以IκB/p65/p50無活性三聚體的形式存在[12]。在LPS作用作用下，IκB蛋白容易出現(xiàn)磷酸化、解離、降解等現(xiàn)象。與此同時，游離的NF-κB將從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入至細(xì)胞核內(nèi)，再與結(jié)合位點相結(jié)合、啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA及蛋白質(zhì)[13]。本實驗結(jié)果顯示，在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中，該化合物顯著抑制p65和IκB的磷酸化，同時抑制IκB的降解。因此，該化合物可能能夠抑制NF-κB信號通路的活化。一般情況下，在雙重信號協(xié)同作用下，NLRP3炎癥小體將經(jīng)歷激活、轉(zhuǎn)錄、活化和釋放等過程。本實驗結(jié)果表明，該化合物能夠抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表達(dá)，與此同時降低IL-1β mRNA的表達(dá)。在體內(nèi)實驗中，該化合物對LPS引起的小鼠急性肺損傷也具有緩解作用。這些結(jié)果提示該化合物可能通過NF-κB/ NLRP3炎癥小體信號通路來發(fā)揮抗炎活性。其可能的作用機(jī)制如Fig 11所示。本論文的結(jié)果對高效抗炎小分子化合物的設(shè)計與優(yōu)化具有參考意義。