張雪娣，丁 寧，穆云萍，李芳紅，趙子建

(廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

在世界范圍內(nèi)，男性不孕不育比例正在逐年上升。世界衛(wèi)生組織預(yù)測,在21世紀(jì),不孕不育將成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三大頑疾，因此，不孕不育癥等人群的生殖健康情況也被看作是全世界范圍內(nèi)須重點(diǎn)關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。研究顯示，25%-30%的不孕夫婦是由于男性因素導(dǎo)致不孕，而其高達(dá)90%的問題都是源于精子數(shù)量減少、精子活力低下和精子畸形[2]，但其具體發(fā)病機(jī)制仍不完善。

有性生殖是真核生物最常見的生殖形式，以一系列大規(guī)模的細(xì)胞或組織修復(fù)為特征。近年來的研究表明，在哺乳動(dòng)物中，自噬是精子發(fā)生和卵子發(fā)生所不可缺少的，它參與胚胎的早期發(fā)育，為親本和子代之間提供了分子基礎(chǔ)[3]，是造福下一代的重要途徑。自噬在正常的生理過程中起著“管家”的作用，也是機(jī)體實(shí)現(xiàn)物質(zhì)再循環(huán)、維持細(xì)胞代謝平衡及內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種重要的細(xì)胞機(jī)制[4]。

大量的研究證明，睪丸內(nèi)精子發(fā)生的過程中自噬的有序發(fā)生對(duì)于維持精原細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[5]、調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的凋亡、精子頂體的形成[6]和非必須成分的降解[7]至關(guān)重要。研究表明，睪丸內(nèi)的精子產(chǎn)生后，需經(jīng)過附睪才能成熟并獲得運(yùn)動(dòng)和識(shí)別卵子透明帶的能力，附睪在精子成熟、保護(hù)、運(yùn)輸和貯存過程中發(fā)揮著重要作用[8]。根據(jù)生化功能和結(jié)構(gòu)差異可將附睪分為3部分：頭、體和尾。根據(jù)蛋白表達(dá)不同，又可細(xì)分為10部分[9]，其中，附睪頭分泌的蛋白約占管腔內(nèi)總蛋白的90%，是最具代謝活性的區(qū)域[8]，也是使精子獲得運(yùn)動(dòng)能力的重要部位。研究表明，在附睪頭中，其4-5段的自噬核心蛋白Atg5在附睪頭4-5段表達(dá)量最較高，說明自噬可能參與了附睪頭中的某些生物學(xué)功能(精子成熟、蛋白和離子的分泌與吸收等)，然而，目前自噬在附睪中的功能尚不明確。因此我們提出科學(xué)假設(shè)：附睪頭中的自噬功能在精子成熟的過程中發(fā)揮重要作用，并通過附睪頭4-5段主細(xì)胞中Atg5特異性敲除小鼠模型探討附睪頭4-5段Atg5的缺失對(duì)附睪功能以及精子成熟過程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Lcn5-Cre基因工程小鼠模型由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院張永蓮研究員所提供，附睪頭4-5段主細(xì)胞中Atg5特異性敲除小鼠模型購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0010。小鼠于廣東藥科大學(xué)動(dòng)物中心的無菌環(huán)境中進(jìn)行繁殖和飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào)為SYXK(粵)2017-0125。動(dòng)物保護(hù)指南是由廣東藥科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)所制定。

1.1.2試劑 DNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；Atg5抗體(CST12994，CST)；LC3(CST4108S，CST)；p62(CSTS144S，CST)；蘇木素伊紅染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(陜西圣奧動(dòng)物藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型制備 按照基因型將小鼠分為3組，每組6-7只：對(duì)照組(Atg5f/f)、雜合敲除組(Atg5f/-)以及純合敲除組(Atg5-/-)，所有小鼠(每籠1-4只)飼養(yǎng)在可控環(huán)境內(nèi)，光照/黑暗周期12 h，恒溫22 ℃，濕度60%-70%，并自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和高壓滅菌水。小鼠喂食8周后，進(jìn)行合籠實(shí)驗(yàn)，合籠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后喂食至14周，對(duì)雄鼠進(jìn)行取材，取其附睪，一側(cè)放置于4%多聚甲醛中用于固定，一側(cè)附睪尾放入預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水中用于檢測精子活力和精子數(shù)目，附睪頭凍存至-80 ℃。

使用以下引物對(duì)所有小鼠進(jìn)行基因分型，以區(qū)分野生型、雜合敲除基因型和純合敲除基因型。

Atg5-Flox 上游引物：5′-TTCAGTGTACCCTGTGTATTGG-3′,下游引物：5′-GGGAAACAGTTGTGTTCTTTGT-3′;Lcn5-Cre 上游引物：5′-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3′,下游引物：5′-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3′ 。

1.2.2合籠實(shí)驗(yàn) 三組雄鼠與野生型雌鼠以1 ∶2比例進(jìn)行3次為期1周的合籠(每次合籠間隔5 d且更換新的雌鼠)，根據(jù)懷孕雌鼠的數(shù)量計(jì)算每只雄鼠的致孕率。懷孕母鼠分娩后，每胎小鼠的數(shù)量即產(chǎn)仔數(shù)。致孕率計(jì)算公式：單只雄鼠致孕率/%=孕鼠的數(shù)量/6×100%。

1.2.3精子活力的測量 按解剖結(jié)構(gòu)定位切取附睪尾，置于預(yù)熱至37 ℃的500 μL生理鹽水中，將附睪尾剪碎，放置于于37 ℃水浴靜置5 min，使精子充分釋放到生理鹽水中，取3 μL精子懸液，通過精子動(dòng)力分析儀進(jìn)行精子活力的測量。

1.2.4精子數(shù)目的檢測 用生理鹽水將精子懸液稀釋至30倍，吸取10 μL至細(xì)胞計(jì)數(shù)板中于顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通過精子數(shù)量計(jì)算公式得出精子終濃度。精子數(shù)量的計(jì)算公式：精子數(shù)量(個(gè)/mL)=(A+B+C+D)/4×104×30 (稀釋倍數(shù))，其中A、B、C、D 分別為顯微鏡下計(jì)數(shù)板上的4個(gè)區(qū)域內(nèi)的精子數(shù)。

1.2.5病理組織染色 石蠟切片樣本放置60 ℃烘箱中1-2 h→二甲苯10 min→二甲苯10 min→二甲苯10 min→100%乙醇3 min→100%乙醇3 min→95%乙醇3 min→85%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→蒸餾水3 min→蘇木素2 min→蒸餾水2 min→1%鹽酸酒精分化1-3 s→水洗2 min→氨水返藍(lán)10-30 s→80%乙醇2 min→90%乙醇2 min→ 伊紅5 s→蒸餾水2 min,顯微鏡下快速觀察染色效果→100%乙醇3 min→100%乙醇3 min→100%乙醇3 min→二甲苯10 min→二甲苯10 min →二甲苯10 min →中性樹膠封片。

1.2.6免疫熒光 石蠟切片樣本放置60 ℃烘箱中1-2 h→二甲苯10 min→二甲苯10 min→二甲苯10 min→100%乙醇3 min→100%乙醇3 min→95%乙醇3 min→85%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→PBS浸泡5 min→檸檬酸納修復(fù)15 min→PBST 洗5 min，3次→Triton 5 min→PBST 洗5 min，3次→5%驢血清封閉封閉1 h→4 ℃過夜敷一抗(2.5%驢血清稀釋一抗)→PBST 洗5 min，3次→避光操作→室溫敷二抗1 h(PBS稀釋)→PBS洗5 min，3次→DAPI 5 min→PBS洗5 min，3次→封片，避光條件下使用熒光顯微鏡觀察。

為了探究對(duì)外直接投資與企業(yè)績效之間的因果關(guān)系，最優(yōu)方法是測算對(duì)外直接投資企業(yè)在投資前與投資后的企業(yè)績效差異水平。但是對(duì)外直接投資企業(yè)的未投資情形是一種 “反事實(shí)”，故本文采用Heckman等 （1997）提出的傾向得分匹配法 （PSM）解決上述問題，同時(shí)可以控制上市公司樣本局限的選擇性偏差和個(gè)體差異所致的混合性偏差，有效規(guī)避對(duì)外直接投資的內(nèi)生性問題（薛安偉， 2017）［11］。

1.2.7附睪組織蛋白的檢測 從-80 ℃冰箱取出組織，置于1.5 mL離心管中，加入150 μL RIPA和3 μL PMSF，放入勻漿儀中進(jìn)行研磨，得到組織勻漿，冰上靜置5 min后，1 2000g，4 ℃離心20 min，吸取上清至新的1.5 mL EP管中，BCA測量蛋白濃度，加入5× Loading Buffer，放入95 ℃水浴中，10 min，使蛋白變性，通過Western blot 檢測附睪頭ATG5的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 附睪頭4-5段主細(xì)胞中Atg5特異性敲除模型鼠的鑒定將轉(zhuǎn)基因小鼠合籠一周(雄鼠 ∶雌鼠=1 ∶2)進(jìn)行子代的繁育，剪取子代小鼠的尾巴，進(jìn)行 DNA的提取，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)對(duì)小鼠進(jìn)行基因型鑒定，并通過特異性引物來區(qū)分野生型、雜合基因型和純合敲除基因型小鼠(Fig 1B)。

Fig 1 Generation of Atg5 conditional knockout mice (Atg5-/-)A:Schematic diagram of epididymal caput structure.B:Genotyping of the mice was performed by PCR using specific primers to distinguish wild-type or Atg5-/-.

2.2 附睪頭4-5段Atg5表達(dá)水平的檢測在基因鑒定的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步通過Western blot和免疫熒光技術(shù)來檢測3組轉(zhuǎn)基因小鼠的Atg5敲除效率，結(jié)果顯示，較Atg5f/f和Atg5f/-小鼠相比，Atg5-/-小鼠附睪頭4-5段中的ATG5的表達(dá)水平顯著降低(P<0.0001)；此外，免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Atg5f/f和Atg5f/-小鼠相比，Atg5-/-小鼠附睪頭4-5段綠色熒光極其微弱，表明ATG5表達(dá)量極微，說明附睪頭4-5段主細(xì)胞幾乎沒有Atg5基因表達(dá)，即特異性敲除小鼠模型構(gòu)建成功。

2.3 小鼠附睪頭4-5段主細(xì)胞中Atg5的缺失對(duì)其自噬水平的影響為了探索Atg5的特異性敲除對(duì)敲除部位自噬發(fā)生水平的影響，我們通過Western blot檢測了附睪頭4-5段自噬底物類似物p62、以及自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 的蛋白豐度。結(jié)果表明，與Atg5f/f和Atg5f/-小鼠相比，Atg5-/-小鼠附睪頭4-5段的p62以及LC3-Ⅰ 蛋白的表達(dá)水平顯著上升(Fig 3A，3B)(P<0.001)，LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ的比值也增加(P<0.01)，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化受阻。以上結(jié)果表明，Atg5-/-小鼠的Atg5基因特異性敲除后，附睪頭4-5段主細(xì)胞的自噬過程被阻斷。

Fig 2 Atg5 deletion in caput epididymidisA:Detection of Atg5 in caput epididymidis using Western blotting,and the protein level was normalized to Actin (,n=6).B:Immunostaining of Atg5 in caput and cauda epididymidis.Bar =50 μm.ATG5,green ;DNA ,blue.**P<0.01 vs Atg5-/-

2.4 附睪頭4-5段Atg5缺失對(duì)其組織形態(tài)的影響為了研究Atg5的缺失對(duì)附睪頭4-5段組織形態(tài)的影響，我們對(duì)3種不同基因型小鼠的附睪頭4-5段的組織進(jìn)行了H&E染色。從病理組織切片結(jié)果(Fig 4)得知，Atg5-/-小鼠附睪頭4-5段組織的管腔排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，與Atg5f/f和Atg5f/-小鼠相比，沒有發(fā)生明顯變化。說明，在自然條件下，Atg5缺失對(duì)附睪頭4-5段的組織形態(tài)沒有影響。

2.5 附睪頭4-5段Atg5缺失對(duì)雄性小鼠精子活力、精子數(shù)目、致孕率以及產(chǎn)仔率的影響為了探索Atg5的缺失對(duì)雄性小鼠生殖能力的影響，在小鼠8周齡時(shí)，我們通過合籠實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的致孕率和產(chǎn)仔數(shù)，并在小鼠14周齡時(shí)，檢測3組雄性小鼠的精子活力和精子數(shù)目。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，Atg5f/f、Atg5f/-和Atg5-/-3種基因型小鼠之間的精子活力(Fig 5A)、精子數(shù)目(Fig 5B)、致孕率(Fig 5C)及產(chǎn)仔數(shù)(Fig 5D)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明自然條件下，Atg5的缺失對(duì)雄性小鼠的精子活力、精子數(shù)目以及生殖能力沒有影響。

Fig 3 The decreased autophagy activity in caput of the Atg5-/- mice epididymisA:Detection of p62 in caput epididymidis using Western blot ( ,n=6).B:Detection of LC3 in caput epididymidis using Western blot ( ,n=6).**P<0.01 vs Atg5-/- .

Fig 4 HE staining of caput epididymidis in 14-week-old mice(Bar = 50 μm).From left to right：Atg5f/f ,Atg5f/- ,Atg5-/-

Fig 5 Effect of deletion of Atg5 in caput epididymidis on sperm motility,sperm count,litter rize and pregnancy rate A：Sperm motility ( ,n=7)；B：Sperm count ( ,n=7)；C：Litter rize ( ,n=52).(D) Pregnancy rate ( ,n=7).

3 討論

自噬是一個(gè)高度保守的細(xì)胞內(nèi)溶酶體分解代謝的過程，降解、清除細(xì)胞內(nèi)部分非功能性蛋白或胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)成分，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境能量新陳代謝[4]。自噬有3種主要途徑：巨自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬是最普遍的形式，通常稱為自噬。在自噬的發(fā)生過程中，細(xì)胞首先形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，自噬泡雙層膜經(jīng)過延伸閉合，包裹著待降解的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器形成自噬體，隨后自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體[4]，最后，溶酶體通過各種水解酶將自噬溶酶體中包裹的物質(zhì)降解，促進(jìn)細(xì)胞更新代謝[10]。有研究表明自噬參與精子的分化和成熟，自噬的缺失會(huì)導(dǎo)致精子活力減弱，精子形態(tài)遭到破壞，出現(xiàn)嚴(yán)重的畸形精子癥[11]，可見自噬功能對(duì)精子發(fā)生有著重要的調(diào)控作用。

精子發(fā)生指的是在睪丸中產(chǎn)生有功能的精子細(xì)胞的過程，睪丸中產(chǎn)生的精子需在附睪中成熟并在女性生殖道中完成獲能才具備與卵子結(jié)合的能力，從而參與授精過程。既往的研究多數(shù)聚焦于精子在生殖道的獲能過程。而對(duì)于精子在附睪頭中成熟機(jī)制調(diào)控的相關(guān)研究少之又少，尤其是在附睪頭中，自噬對(duì)于精子成熟的調(diào)控機(jī)制更是尚不明確。因此，本研究利用附睪頭4-5段主細(xì)胞Atg5特異性敲除模型鼠，深入研究附睪頭4-5段自噬功能在精子成熟過程中發(fā)揮的作用。

自噬發(fā)生時(shí)，Atg5可與Atg12、Atg16L1形成多聚體，參與LC3-Ⅰ型(游離型)向LC3-Ⅱ型(膜結(jié)合型)的轉(zhuǎn)化，從而進(jìn)一步參與自噬泡雙層膜的形成[10]。研究表明，自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ型轉(zhuǎn)化效率顯著降低時(shí)，自噬泡雙層膜的形成受阻，從而使與LC3和泛素化蛋白相連接的自噬底物類似物p62蛋白水平顯著上升[12]，此時(shí)自噬過程被成功阻斷。本研究首先驗(yàn)證了附睪頭4-5段Atg5的特異性敲除成功，并進(jìn)一步驗(yàn)證了隨著Atg5的敲除，純合敲除組(Atg5-/-)出現(xiàn)了自噬底物類似物p62積累以及LC3-Ⅰ至LC3-Ⅱ型轉(zhuǎn)化受阻，表明純合敲除組的附睪頭4-5段自噬過程被阻斷，同時(shí)也說明自噬在附睪頭中是以特定的節(jié)律進(jìn)行著。

為了檢測Atg5缺失及自噬阻斷對(duì)雄性小鼠生殖能力和精子成熟過程的影響，我們?cè)?周齡時(shí)對(duì)對(duì)照組(野生型)、雜合敲除組和純合敲除組小鼠的致孕率和產(chǎn)仔數(shù)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，在8周齡時(shí)3組小鼠的致孕能力與產(chǎn)仔數(shù)量均無差異。隨后，在14周齡時(shí)，我們檢測了附睪頭組織形態(tài)、附睪尾精子數(shù)量以及精子活力的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組野生型小鼠相比，純和敲除組、雜合敲除組的附睪頭組織形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化，精子數(shù)目、精子活力也沒有受到影響。說明，在正常情況下，附睪頭4-5段Atg5基因缺失不會(huì)影響精子的成熟。

已有研究發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞中Atg5的缺失破壞了自噬通量，導(dǎo)致頂體生物發(fā)生缺陷、線粒體重排、剩余細(xì)胞質(zhì)和殘?bào)w保留以及個(gè)體化失敗[13]，使精子的形成和功能受損，從而導(dǎo)致生育能力下降。但結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，純合敲除鼠的附睪頭組織形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化，而且精子數(shù)目、精子活力、致孕率以及產(chǎn)仔數(shù)也沒有受到影響。這一結(jié)果提示我們：第一，在附睪頭4-5段可能發(fā)生不依賴于Atg5的替代性自噬。這種不依賴于Atg5的自噬最初檢測到的是在Atg5-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞[14]中，隨后發(fā)現(xiàn)其在紅細(xì)胞分化和分化細(xì)胞向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中調(diào)節(jié)線粒體清除[15]。以及在Atg5-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中檢測到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生成的自噬體樣結(jié)構(gòu)，提示傳統(tǒng)的自噬仍在緩慢發(fā)生[16]。因此，不依賴于Atg5的替代性自噬或殘存的自噬活性可能使附睪頭4-5段保持原有功能，維護(hù)精子的成熟，形成有功能的精子；第二，自噬是機(jī)體細(xì)胞的自我保護(hù)的程序，例如當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí),會(huì)通過激活自噬來為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì),因此不排除附睪組織中的自噬功能只有在應(yīng)激情況下才會(huì)參與到精子成熟的調(diào)控，而正常情況下Atg5缺失對(duì)附睪的功能和精子的成熟沒有影響。第三，以Lcn5啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)的Cre酶是在小鼠出生后30 d才逐漸有表達(dá)的[17]，因此我們不能排除ATG5蛋白及其參與的自噬功能是在出生前30 d內(nèi)(即附睪組織細(xì)胞的分化過程中)發(fā)揮作用的。綜上，我們會(huì)繼續(xù)關(guān)注Atg5的缺失引起的局部功能和蛋白的變化以及應(yīng)激條件下、出生后的生命早期Atg5的缺失對(duì)精子成熟過程的影響。

雖然本研究中自然條件下未發(fā)現(xiàn)Atg5缺失會(huì)對(duì)精子成熟過程產(chǎn)生影響，但本研究對(duì)于后續(xù)圍繞自噬在附睪中的功能開展研究，有一定的借鑒和參考意義。在后續(xù)的研究中，期待闡明自噬是否在生命早期參與了附睪上皮細(xì)胞的分化過程、自噬是否調(diào)控了附睪內(nèi)一些蛋白分泌過程、應(yīng)激條件下自噬是否能緩解附睪中精子成熟異常的狀況。