侯道榮，劉 振，崔斯童，馬 駿

(1.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心，江蘇 南京 211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院神經(jīng)外科，南京市第一醫(yī)院，江蘇 南京 210006)

炎癥通常被認(rèn)為是對感染或損傷的防御反應(yīng)，但是，如果過度或持續(xù)，它將導(dǎo)致多種炎癥疾病，如敗血癥、關(guān)節(jié)炎、癌癥、動脈粥樣硬化和自身免疫性疾病的發(fā)生[1]。炎癥的發(fā)病機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，受細(xì)胞因子和多種促炎性因子的誘導(dǎo)，如前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的調(diào)節(jié)[2]。在許多急慢性炎癥性疾病中，過度產(chǎn)生的促炎癥介質(zhì)會進(jìn)一步加重了炎癥浸潤和免疫反應(yīng)[3]。因此，這些促炎性介質(zhì)是開發(fā)抗炎藥的重要靶點。

巨噬細(xì)胞廣泛分布于體內(nèi)，在炎癥反應(yīng)中起重要作用[4]。巨噬細(xì)胞通過模式識別受體(PPR)識別致病物質(zhì)并利用促炎性因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[5]。脂多糖(LPS)是常用的巨噬細(xì)胞激活劑[6]。LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分，其誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的激活是TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)包含NFκB信號級聯(lián)的結(jié)果[7]。研究表明[8]，NFκB的激活可導(dǎo)致促炎性介質(zhì)，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放。

丹參酮Ⅱ-A(Tan IIA)是從丹參中提取的脂溶性化合物。已證明Tan IIA在抗炎活性中起重要作用[9]。Tan IIA用于治療各種炎癥反應(yīng)，如脂多糖誘導(dǎo)的THP巨噬細(xì)胞炎癥骨腫瘤、動脈粥樣硬化和心血管疾病的脊髓炎癥[7]；Tan IIA能有效抑制大鼠腦缺血/再灌注損傷模型中促炎細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-6的釋放[10]。本研究將探究Tan IIA對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞炎癥的具體的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑Tan IIA(T4952，美國Sigma公司)，使用DMSO 溶液配制；LPS(L2630，美國Sigma公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(11960044，美國Gibco公司)、胎牛血清(10099，美國Gibco公司)、青鏈霉素(15070063，美國Gibco公司)、L-谷氨酰胺(25030081，美國Gibco公司)；TNF-α ELISA 檢測試劑盒(EK0527，武漢博士德生物工程有限公司)、IL-6 ELISA 檢測試劑盒(EK0411，武漢博士德生物工程有限公司)；IL-1β ELISA檢測試劑盒(AE58504HU，中國Abebio公司)、CCK-8試劑盒(OCPA(C)20132001，中國和元生物技術(shù)有限公司)；蛋白檢測試劑盒(23225，美國Thermo Fisher Scientific公司)；ECL Western blot底物(35055，美國Thermo Fisher公司)；MMP-2 兔單克隆抗體(ab92536，1 ∶1 000，英國Abcam公司)、MMP-9兔多克隆抗體(ab38898，1 ∶1 000，英國Abcam公司)、NF-κB 兔單克隆抗體(ab32360，1 ∶1 000，英國Abcam公司)、p-NFκB 兔多克隆抗體(ab28849，1 ∶1 000，英國Abcam公司)、TLR4兔單克隆抗體(ab22048，1 ∶1 000，英國Abcam公司)、IκB-α 兔單克隆抗體(ab32518，1 ∶1 000，英國Abcam公司)、p-IκB-α兔單克隆抗體(ab92700，1 ∶1 000，英國Abcam公司)；GAPDH兔單克隆抗體(A19056，1 ∶1 000，中國Abclonal公司)；羊抗兔IgG辣根過氧化物酶二抗(ab7090，1 ∶1 000，英國Abcam公司)；羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶二抗(ab97040，1 ∶1 000，英國Abcam公司)。

1.3 儀器全波長多功能酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司)，遷移小室(美國Corning公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；光學(xué)倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞以1×106/孔的密度接種于6孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基添加10% (V/V) FBS,1×105IU·L-1青霉素G,100 kg·L-1鏈霉素和2 mL谷氨酰胺。細(xì)胞于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.2 分組與干預(yù)RAW 264.7細(xì)胞以1 × 106/孔的密度鋪于6孔板，鋪板后d 2使用隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞板分隨機(jī)分為模型組(LPS)、干預(yù)組(LPS+Tan IIA)和對照組(DMSO)。LPS組，細(xì)胞加入1 mg·L-1LPS培養(yǎng)24 h；LPS+Tan IIA組，細(xì)胞加入Tan IIA(終濃度為10 μmol·L-1，Tan IIA溶于DMSO)培養(yǎng)2 h，隨后加入1 mg·L-1LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h；DMSO組，細(xì)胞加入等體積的DMSO培養(yǎng)24 h。所有實驗重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞增殖測定RAW264.7細(xì)胞活力測定使用CCK-8試劑盒進(jìn)行。各組細(xì)胞更換培養(yǎng)基后，按照CCK-8試劑盒說明書操作。RAW264.7細(xì)胞以每孔1 × 104的密度鋪于96孔板中(設(shè)置6個復(fù)孔)，并且使用DMSO、LPS、LPS +Tan IIA處理細(xì)胞。72 h的孵育期間，每24 h每孔加入10 μL CCK-8。使用酶標(biāo)儀測定每孔450 nm的吸光度值(OD)。

2.4 細(xì)胞遷移測定將所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和遷移板放在37 ℃培養(yǎng)箱溫育；待RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌1次，用100 μL無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2×108·L-1；在遷移板下室(即24孔板底部)加入700 μL 含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h；用鑷子小心取出遷移檢測板，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min；取出遷移檢測板，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800 μL Giemsa染液的孔中，室溫染色20 min；輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出小室，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；顯微鏡下隨機(jī)取9個視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。實驗組中遷移的細(xì)胞數(shù)除以對照組中遷移的細(xì)胞數(shù)，再乘以100%即為相對遷移率。

2.5 細(xì)胞炎性因子檢測取對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞，按5×105/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h。待其貼壁后棄去上清液，加入試劑繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用1.5 mL離心管收集上清，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-1β的含量。

2.6 Western blot 檢測使用Western blot檢測各組細(xì)胞中信號通路相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9、NF-κB、p-NFκB、TLR4、IκB-α和p-IκB-α的表達(dá)。細(xì)胞勻漿后分離蛋白，用含1mmol·L-1PMSF的RIPA冰裂解緩沖液4 ℃孵育10 min,12 000g離心10 min。用Pierce BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。然后用SDS-PAGE將同樣定量的蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移到0.2 μm PVDF膜上。在室溫下用含3% (W/V) BSA的TBST緩沖液中封閉后，一抗4 ℃孵育過夜。用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。使用Pierce ECL Western blot底物檢測蛋白。使用ImageJ軟件定量，使用GraphPad Prism軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1 Tan IIA對LPS處理的RAW 264.7細(xì)胞增殖的作用LPS能誘導(dǎo)RAW264.7的分化并且抑制RAW264.7的增殖[6]。為了評估丹參酮II-A對RAW 264.7細(xì)胞增殖活力的影響，我們使用不同濃度Tan IIA(0、2、5、10、15 μmol·L-1)對RAW 264.7細(xì)胞進(jìn)行處理,培養(yǎng)24 h后，每孔加人10 μL的CCK-8試劑孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測OD450值(Fig 1)。實驗結(jié)果表明LPS明顯抑制RAW 264.7細(xì)胞的增殖；和LPS處理組比較，Tan IIA(終濃度10 μmol·L-1)處理24 h對可明顯逆轉(zhuǎn)LPS對RAW 264.7增殖的抑制作用(P<0.05)。因此我們選擇10 μmol·L-1Tan IIA用于后續(xù)實驗。

Fig 1 Effects of different concentrations of Tan IIA on RAW264.7 cell viability (,n=6)*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group.

3.2 Tan IIA對LPS處理的RAW264.7細(xì)胞遷移的作用我們使用細(xì)胞遷移實驗檢測Tan IIA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞遷移的作用(Fig 2)。實驗結(jié)果表明，LPS處理明顯增加了RAW 264.7細(xì)胞的遷移，和DMSO組比較，P<0.01(Fig 2A,B)；Tan IIA處理可明顯抑制LPS對RAW 264.7遷移的促進(jìn)作用，和LPS組比較，P<0.01。

3.3 Tan IIA抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基上清的4種主要的趨化因子和炎性因子(TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-1β)使用ELISA方法檢測(Fig 3)。結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β和趨化因子MCP-1明顯增加，和DMSO組比較，P<0.01；Tan IIA處理可明顯降低RAW 264.7細(xì)胞的炎性因子水平，和LPS組比較，P<0.01。這些結(jié)果表明，Tan IIA可以通過降低RAW264.7細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生來抑制LPS引發(fā)的炎癥反應(yīng)。

3.4 Tan IIA通過RAW264.7細(xì)胞炎性通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響我們使用Western blot方法檢測Tan IIA對RAW264.7細(xì)胞炎性相關(guān)通路蛋白的表達(dá)(Fig 4A)。結(jié)果表明，與DMSO組比較，LPS誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9的明顯升高(P<0.05和P<0.01。而和LPS組比較，Tan IIA明顯抑制LPS誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9的升高(P<0.05 和P<0.01)。各組細(xì)胞間NFκB和IκB的表達(dá)差異無顯著性。LPS誘導(dǎo)p-NFκB、TLR4和p-IκB的明顯提高，和DMSO組比較，P<0.01。Tan IIA明顯抑制LPS誘導(dǎo)的p-NFκB、TLR4和p-IκB的升高，和LPS組比較，P<0.01。

Fig 2 Tan IIA restored migration capacity of LPS-stimulated RAW264.7 cells (,n=6)**P<0.01 vs DMSO group;##P<0.01 vs LPS group.

Fig 3 Tan IIA treatment ameliorated inflammatory cytokine up-regulation in LPS-stimulated RAW264.7 cells(,n=6)The concentration of four inflammatory cytokines IL-1β (A),TNF-α (B),IL-6 (C) and MCP-1 (D) in RAW264.7 cells was examined by ELISA.**P<0.01 vs DMSO group;##P<0.01 vs LPS group.

Fig 4 Tan IIA inhibited protein expression of TLR4/IκBα/NFκB pathway and MMP-2,MMP-9 expression in LPS-stimulated RAW264.7 cells (,n=6)A:Western blot analysis of protein levels in DMSO,LPS or Tan IIA +LPS treated RAW264.7 cells;B:Data are shown as .*P<0.05,**P<0.01 vs DMSO group;#P<0.05,##P<0.01 vs LPS group.

4 討論

小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7被認(rèn)為是檢測感染相關(guān)的促炎性介質(zhì)最敏感和有效的模型[6]。它可以被LPS觸發(fā)，作為研究炎癥反應(yīng)的經(jīng)典模型。循環(huán)血單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞可參與炎癥反應(yīng)[11]。RAW264.7細(xì)胞是Abelson小鼠白血病病毒轉(zhuǎn)化的巨噬細(xì)胞，是最常用的巨噬細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ停诰奘杉?xì)胞相關(guān)炎癥信號通路的研究中發(fā)揮重要作用[3]。近年來，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞被廣泛用于篩選有效的抗炎藥物。因此，我們選擇這一典型模型，探討Tan IIA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥反應(yīng)的作用和機(jī)制。

Tan IIA是丹參的主要脂溶性成分之一，是一種眾所周知的黃酮類化合物，對炎癥反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用[12]。Tan IIA對動脈粥樣硬化和相關(guān)炎癥反應(yīng)具有明顯療效[13]。此外，研究顯示，Tan IIA能有效抑制大鼠腦缺血/再灌注損傷模型中促炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α和IL-6等的釋放[10]。最近的研究表明，Tan IIA可以減少博萊霉素和LPS誘導(dǎo)的大、小鼠肺的炎癥細(xì)胞浸潤、促炎性細(xì)胞因子釋放和膠原沉積[14]。因此，Tan IIA被認(rèn)為是一種很有前景的抗炎藥物。在本研究中，Tan IIA能有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活力的下降、細(xì)胞遷移和TNF-α、IL-6、MCP-1、MCP-9等炎性因子的釋放和表達(dá)。

為了探究Tan IIA抗炎性作用的具體機(jī)制，本研究檢測了RAW264.7細(xì)胞炎性相關(guān)蛋白的表達(dá)。Tan IIA 能抑制LPS誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9的高表達(dá)。單核細(xì)胞趨化蛋白酶(MMPs)可特異的降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Ⅳ型膠原，對細(xì)胞的遷移、侵襲、活化及血管重塑等均起著重要作用[15]。MMP-2和MMP-9增多可使細(xì)胞基質(zhì)膜成分降解，介導(dǎo)單核細(xì)胞等穿過血管，在降解的細(xì)胞外基質(zhì)中游走，向靶器官浸潤，促進(jìn)炎癥反應(yīng)及組織損傷[16]。MMP對細(xì)胞的遷移、侵襲、活化及血管重塑等均起著重要作用。有研究顯示，MMP-2和MMP-9高表達(dá)與卵巢癌的生長和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，本研究表明Tan IIA可通過抑制MMPs的表達(dá)來發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞炎性的作用。

此外，LPS還誘導(dǎo)TRL4、p-NFκB和p-IκB的高表達(dá)，而這些可以通過Tan IIA治療逆轉(zhuǎn)。因此，我們可以推斷Tan IIA通過抑制TRL4/IκB/NFκB信號通路發(fā)揮抗炎性作用。這表明，抑制RAW 264.7巨噬細(xì)胞IκB活化從而抑制NFκB信號通路，可調(diào)節(jié)LPS對炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用。研究表明，抑制NFκB活性，可改善類風(fēng)濕性滑膜的炎癥反應(yīng)和組織破壞[2]。在結(jié)腸炎模型中，對NFκB的抑制可通過下調(diào)NFκB介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子改善結(jié)腸炎癥損傷[17]。TLR4是Toll樣受體，是一種能夠識別LPS與細(xì)胞表面的髓樣分化因子2(MD2)的模式識別受體。TRL4被LPS激活后可磷酸化IκB-α，然后使NFκB磷酸化，從而使NFκB進(jìn)入細(xì)胞核[18]。IκB-α磷酸化導(dǎo)致其降解并允許NFκB進(jìn)入細(xì)胞核。NFκB的啟動子活性主要是由核移位和NFκB磷酸化引起的。NFκB磷酸化激活導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),如TNF-α、IL-1β、IL-6，MCP-1、MMP-9等的釋放。

綜上所述，本研究闡明Tan IIA可以通過調(diào)控TLR4/IκB-α/NFκB 炎癥信號通路，抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和MMPs的表達(dá)來發(fā)揮抗炎活性，為抗炎性藥物篩選提供了實驗依據(jù)。