彭德威，周慧珊，劉海燕，高小燕，賴穎瑜,3，李巧巧，鄧春玉，楊 慧，鄺素娟，薛玉梅，吳書林，饒 芳

(1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省心血管病研究所心內(nèi)科，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080；3.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

房顫(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一，可導(dǎo)致中風(fēng)和心力衰竭等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存[1-2]。衰老是房顫的獨立危險因素，房顫發(fā)病率隨著年齡的增長而增加[3]。在60-65歲的人群中發(fā)生房顫的比例不到1%，而80歲以上人群則高達(dá)8%-10%[4]。但衰老在房顫發(fā)病機(jī)制中的作用尚未闡明。

心房肌細(xì)胞電重塑是房顫的主要病理機(jī)制之一，其主要標(biāo)志是心房有效不應(yīng)期縮短，頻率適應(yīng)性喪失和心房傳導(dǎo)延長。心房肌細(xì)胞鈣蓄積，使內(nèi)向L型鈣電流(L-type calcium channel current，ICa,L)減少，導(dǎo)致心房有效不應(yīng)期縮短和多子波-折返通路形成和維持，進(jìn)而導(dǎo)致房顫的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，衰老心臟的心房肌細(xì)胞ICa,L減少，心房有效不應(yīng)期縮短，并出現(xiàn)心肌肥大和凋亡，心房纖維化等病理改變，房顫易感性增加[5]。但目前關(guān)于衰老導(dǎo)致房顫的具體分子機(jī)制研究較少。

轉(zhuǎn)錄輔激活因子p300是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的橋梁，參與調(diào)控細(xì)胞周期、分化和凋亡[6]。研究表明，在人肺成纖維細(xì)胞中，p300是復(fù)制性衰老表型的主要驅(qū)動力，抑制p300可延緩復(fù)制性衰老的進(jìn)程[7]。在小鼠心衰模型中，p300通過乙酰化Ca2+-ATP酶SERCA2a并抑制其功能，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡從而導(dǎo)致心肌功能障礙[8]。但p300是否通過調(diào)控ICa,L，在衰老相關(guān)心房肌細(xì)胞電重塑中發(fā)揮重要作用，目前尚無相關(guān)研究報道。本研究旨在探討p300在調(diào)控老年心房肌細(xì)胞電重塑中的作用，為臨床上衰老相關(guān)房顫的防治提供新策略。

1 材料

1.1 動物由廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供的SPF級C57BL/6雄性小鼠，分別是5、13和18月齡，許可證號為SCXK(粵)2013-0034。部分18月齡小鼠隨機(jī)分組，分別給予低劑量(50 mg·kg-1·d-1，n=10)和高劑量(100 mg·kg-1·d-1，n=10)的姜黃素飼養(yǎng)。本研究所有的動物實驗已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)動物實驗倫理審查(No GDREC2016128A)。

1.2 主要試劑與儀器抗p300抗體(Millipore)；抗Cav1.2抗體(Alomone)；抗p53抗體(Cell Signaling Technology)；抗p21抗體(Santa Cruz)；GAPDH抗體 (Cell Signaling Technology)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Invitrogen)；硝酸纖維素膜PVDF膜(Millipore)；Langendorff 恒流灌流裝置；姜黃素(Cayman)；4×蛋白上樣緩沖液(Bio-RAD)；RIPA裂解液(Beyotime)。實驗設(shè)備包括恒溫水循環(huán)灌流裝置(Narishige,Japan)，P97拉制儀(Sutter,America)，MultiClamp 700B膜片鉗放大器及附件(Axon,America)。

2 方法

2.1 小鼠心房快速起搏稱取小鼠體質(zhì)量，腹腔注射3%(30 mg·kg-1)戊巴比妥鈉。將小鼠仰位固定于實驗臺上，使用小動物溫控加熱墊監(jiān)測溫度并將其保持在(37-38) ℃之間。備皮、局部消毒。將鉑金針刺電極連接到小鼠的四肢，使用iWorx數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)對小鼠心電圖進(jìn)行記錄和分析，連續(xù)記錄Ⅰ和Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端。血管中段穿過兩根手術(shù)線備用，血管夾夾閉近心端。在右側(cè)頸靜脈作小切口，置入鞘管，固定近心端。在心腔內(nèi)心電圖和體表心電圖監(jiān)測下沿鞘管送入電極導(dǎo)管，松開近心端血管夾，將心電導(dǎo)管送入右心房。

以1 ms的起搏脈寬，比基礎(chǔ)心率快10 beat·min-1的起搏頻率進(jìn)行起搏閾值測定。以心腔內(nèi)心電圖出現(xiàn)高大A波小V波為理想的記錄圖。電極導(dǎo)管放置到位，以確保獲得恒定的心房奪獲并達(dá)到最小起搏閾值，固定電極導(dǎo)管。采用心房爆發(fā)式起搏(Burst)模式，設(shè)置刺激幅度為2倍的起搏閾值，刺激脈寬為1 ms，進(jìn)行15 s的起搏，實驗重復(fù)10次。觀察并記錄AF的持續(xù)時間和發(fā)作次數(shù)。AF定義為心房無序的電活動，心電圖表現(xiàn)為P波消失，代之以大小不等間隔不均，形態(tài)不一的f波，RR間期不等，持續(xù)1 s以上。AF誘發(fā)率定義為成功誘發(fā)AF的次數(shù)與總誘發(fā)次數(shù)的比值。AF持續(xù)時間定義為每只小鼠自AF誘發(fā)起始到AF自然終止之間的時距。

2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄使用Langendorff恒流灌流裝置分離小鼠單個心房肌細(xì)胞，6 h之內(nèi)用于電生理實驗。記錄ICa,L的細(xì)胞外液成分(mmol·L-1)：CsCl 100,TEA-Cl 20,Na2-ATP 5,Na2GTP 0.4,EGTA 10，HEPES 10,用Tris將pH調(diào)至7.2。記錄ICa,L的細(xì)胞內(nèi)液成分(mmol·L-1)：Choline-Cl 126，CsCl 5.4,MgCl2·6H2O 1,NaH2PO4·2H2O 0.33,Glucose·H2O 10,HEPES 10,CaCl2·2H2O 2，用CsOH將pH調(diào)至7.4。記錄AP的細(xì)胞外液成分(mmol·L-1)：NaCl 136,KCl 5.4,MgCl2·6H2O 1,D-glucose 10,HEPES 10,CaCl2·2H2O 1.8，NaH2PO4·2H2O 0.33，用NaOH將pH調(diào)至7.4。記錄AP的電極內(nèi)液成分(mmol·L-1)：KCl 140,MgCl2·6H2O 1,HEPES 10,EGTA 5 and Na2-ATP 5，KOH使pH調(diào)至7.2。

采用兩步法拉制玻璃電極，灌注電極內(nèi)液后排出氣泡，置于推進(jìn)器上，控制電極尖端電阻為(2-5) MΩ。高阻封接(阻抗>1 GΩ)后，予負(fù)壓破膜形成穩(wěn)定的全細(xì)胞狀態(tài)，電容及電阻補(bǔ)償后，形成全細(xì)胞記錄。使用Digidata 1 440 A低噪聲數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，通過MultiClamp 700B(Axon公司，美國)放大器記錄信號。使用電壓鉗模式測量并記錄ICa,L和膜電容(membrane capacitance，Cm)，電流鉗模式測量并記錄AP。使用pCLAMP 10.5軟件控制命令電位和數(shù)據(jù)采集。使用Clampfit 10.4軟件對單個全細(xì)胞記錄進(jìn)行數(shù)據(jù)測量。在形成全細(xì)胞狀態(tài)后，將細(xì)胞鉗制在-40 mV，緊接著施于從-50-+50 mV，步階電壓為10 mV，波寬為300 ms，頻率為0.2 Hz的刺激，記錄ICa,L。以峰電流(pA/pF)對膜電位作圖，即得I-V曲線。

3 結(jié)果

3.1 不同月齡小鼠心房組織p300、離子通道和衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)收集不同月齡(5、13和18月齡)C57BL/6小鼠左心耳組織，Western blot檢測組織中p300，L型鈣離子通道Cav1.2，衰老相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá)。結(jié)果顯示，與5月齡小鼠相比，13月齡和18月齡小鼠左心耳p300表達(dá)增加(0.73±0.18 in 5月齡vs1.14±0.23 in 13月齡，1.07±0.18 in 18月齡,P<0.01,n=6)，Cav1.2表達(dá)減少(1.02±0.30 in 5月齡vs0.74±0.20 in 13月齡,P<0.05；0.58±0.08 in 18月齡,P<0.01,n=6)，衰老相關(guān)蛋白p53和p21明顯增加(p53：0.53±0.17 in 5月齡vs0.94±0.14 in 13月齡，P<0.01；0.72±0.22 in 18月齡,P<0.05；p21:0.56±0.16 in 5月齡vs1.06±0.23 in 13月齡,P<0.01；0.98±0.21 in 18月齡,P<0.01,n=6)。提示13月齡和18月齡小鼠左心耳組織p300表達(dá)明顯增加，衰老相關(guān)蛋白表達(dá)增加，而L型鈣通道蛋白表達(dá)減少(Fig 1)。

Fig 1 The protein expression of p300,Cav1.2,p53 and p21 in atrial tissues of C57BL/6 mice at different ages (,n=6).*P<0.05,**P<0.01 vs 5 m group.

3.2 不同月齡小鼠心房肌細(xì)胞ICa,L和APD體外分別分離5月齡和18月齡C57BL/6小鼠左心耳單個心房肌細(xì)胞，膜片鉗技術(shù)檢測心房肌細(xì)胞ICa,L和動作電位時程(action potential duration，APD)。結(jié)果顯示，與5月齡的小鼠相比，18月齡小鼠左心耳心房肌細(xì)胞ICa,L的峰值電流密度明顯減少(在峰值電壓+10 mV時，分別是(-1.84±0.42) pA/pFvs(-1.16±0.32) pA/pF，P<0.01，n=10-11)(Fig 2A、2B)，APD90(78.04±16.52 msvs38.28±5.56 ms)、APD70(44.2±11.77 msvs23.19±5.77 ms)、APD50(23.90±6.78 msvs14.22±5.08 ms)均明顯縮短(P<0.01，n=9-10)(見Fig 2C)，動作電位幅度(action potential amplitude,APA)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 不同月齡小鼠快速心房起搏刺激房性心律失常的可誘發(fā)性5月齡和18月齡C57BL/6小鼠分別予經(jīng)頸靜脈心房快速起搏，觀察房性心律失常的可誘發(fā)性。與5月齡小鼠相比，15 s心房爆發(fā)式起搏后18月齡小鼠的AF誘發(fā)率明顯升高(4%vs14.3%，P<0.01)(Fig 3B)。

3.4 姜黃素處理可降低老年組小鼠房顫可誘發(fā)性以不同劑量姜黃素(50、100 mg·kg-1·d-1，6個月)飼養(yǎng)小鼠至18月齡，予以經(jīng)頸靜脈心房快速起搏，觀察姜黃素對老年小鼠AF可誘發(fā)性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與18月齡小鼠相比，不同劑量的姜黃素處理均可使18月齡小鼠的AF誘發(fā)率降低(18月齡組vs低劑量組，14.3%vs1.36%,P<0.01；高劑量組為1.19%，P<0.01)(Fig 3B)。

3.5 姜黃素處理老年組小鼠可逆轉(zhuǎn)其心房電重塑分離對照組和不同劑量姜黃素處理的18月齡小鼠的左心耳單個心房肌細(xì)胞，膜片鉗技術(shù)檢測相應(yīng)的ICa,L和APD。結(jié)果顯示，姜黃素可使老年組小鼠心房肌細(xì)胞降低的峰值電流密度明顯恢復(fù)(在峰值電壓+10 mV時，18月齡組vs低劑量組,(-1.16±0.32) pA/pFvs(-2.04±0.42) pA/pF，P<0.01；高劑量組為(-1.54±0.37) pA/pF，P<0.01,n=10-13)(Fig 4A、4B)。且與對照組相比，低劑量姜黃素處理組小鼠左心耳細(xì)胞APD90(38.28±5.56 msvs64.53±17.28 ms，P<0.01)、APD70(23.19±5.77 msvs37.29±10.52 ms，P<0.01)、APD50(14.22±5.08 msvs20.76±6.71 ms，P<0.05)延長(n=9-10)(Fig 4C)，動作電位幅度(action potential amplitude，APA)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示姜黃素能改善老年小鼠心房肌細(xì)胞的電重塑。

Fig 2 ICa,L and APD in 5 m and 18 m C57BL/6 mice groups()A:Representative traces of ICa,L and corresponding current-voltage relationships in atrial myocytes from 5 m and 18 m C57BL/6 mice [n=10-11/3-4(atrial myocytes/mice)]；B:Voltage dependence activation,inactivation and time course of recovery for ICa,L in above groups[n=10-20/3-4 (atrial myocytes/mice)]；C:Representative traces of APD in atrial myocytes in above groups [n=9-10/3-4(atrial myocytes/mice)].APA,APD90,APD70,APD50were calculated.**P<0.01 vs 5 m group.

Fig 3 AF incidence induced by rapid atrial pacing in 5 m,18 m mice with or without curcumin treatmentA：Typical surface ECG and intra-atrial electrocardiogram (IAEG)；B：AF incidence in 5-month old，18-month old with or without curcumin treated mice(n=10/8/8/9,respectively).**P<0.01 vs 5-month-old mice;##P<0.01 vs 18-month-old mice.(C) Typical surface ECG recordings in mice with AF that spontaneously reverted to SR.(D) Disorganized atrial wave (f wave).

Fig 4 ICa,L and APD in 18 m C57BL/6 mice with or without curcumin treatment()A:Representative traces of ICa,L and corresponding current-voltage relationships in atrial myocytes [n=10-13/3-4 (atrial myocytes/mice)]；B:Voltage dependence activation,inactivation and time course of recovery for ICa,L [n=10-21/3-4 (atrial myocytes/mice)]；C:Representative traces of APD in atrial myocytes [n=9-10/3-4 (atrial myocytes/mice)].APA,APD90,APD70,APD50 were calculated.*P<0.05,**P<0.01 vs 18 m group,##P<0.01 vs high curcumin group.APA:action potential amplitude.

4 討論

本研究中，我們主要發(fā)現(xiàn)：(1)與年輕組相比，老年小鼠左心耳組織中p300和衰老信號通路p53/p21表達(dá)明顯增加，而鈣通道蛋白Cav1.2表達(dá)明顯減少。左心房心肌細(xì)胞發(fā)生電重塑，表現(xiàn)為ICa,L明顯降低和APD明顯縮短。老年小鼠房顫的可誘發(fā)性明顯增加。(2) p300抑制劑-姜黃素干預(yù)后，可使老年小鼠心房肌細(xì)胞的電重塑明顯改善，APD延長，并可明顯降低老年小鼠的房顫可誘發(fā)性。

細(xì)胞衰老是指增殖中的細(xì)胞，細(xì)胞周期停在G1期，是對應(yīng)激的一種反應(yīng)；主要表現(xiàn)為細(xì)胞變得肥大，端粒酶縮短，衰老相關(guān)蛋白p53、p21表達(dá)增加，衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype)表達(dá)增加[9]。既往研究認(rèn)為心肌細(xì)胞作為終末細(xì)胞，不會發(fā)生增殖，但是近年來的研究表明，心肌細(xì)胞可以緩慢增殖，并可通過干細(xì)胞進(jìn)行部分更新，亦可出現(xiàn)衰老[10]；多種心血管疾病如動脈粥樣硬化、心力衰竭和AF都與衰老密切相關(guān)[3]。有研究表明，老年小鼠心臟線粒體比年輕小鼠產(chǎn)生更多的ROS，機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡能力下降，AF易感性增加[11]。衰老心肌中肌漿網(wǎng)鈣含量減少以及鈣瞬變幅度降低，Ca2+-ATP酶(SERCa2a)表達(dá)減少[5,12]。此外，衰老心臟中，成纖維細(xì)胞增生替代丟失的心肌細(xì)胞，參與衰老相關(guān)結(jié)構(gòu)重塑[13]。然而，目前關(guān)于衰老對心房肌細(xì)胞電重塑影響的機(jī)制研究尚不明確。

轉(zhuǎn)錄輔激活因子p300是一種細(xì)胞內(nèi)普遍存在的核磷酸蛋白，具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，在細(xì)胞增殖、凋亡和胚胎發(fā)育中起重要作用[6,14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，p300純合突變小鼠發(fā)育遲緩，出現(xiàn)較高的早期胚胎死亡率。與野生型胚胎細(xì)胞相比，p300-/-突變型心臟組織中肌球蛋白重鏈(MHC)和α-肌動蛋白表達(dá)顯著減少，并伴有心包積液等致命心血管疾病的風(fēng)險[16]。研究還表明，p300參與細(xì)胞衰老的調(diào)控，p300通過乙?；瘉碚{(diào)節(jié)p53的活性，進(jìn)而參與生長抑制因子2(inhibitor of growth protein 2)誘導(dǎo)的復(fù)制性衰老[17]。在人肺成纖維細(xì)胞中p300的耗竭可以延緩細(xì)胞的衰老，p300過表達(dá)明顯抑制細(xì)胞的增殖[7]。另外，研究表明，在心衰患者中，p300參與心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控。且在小鼠心衰模型中，p300表達(dá)明顯增加，并通過乙?；疭ERCA2a抑制其功能，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡和心肌功能障礙[8]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與年輕組小鼠相比，老年小鼠心房組織的p300表達(dá)明顯增加，衰老信號通路激活，同時出現(xiàn)L型鈣通道蛋白Cav1.2的表達(dá)降低，心房肌細(xì)胞出現(xiàn)電重塑。而給予姜黃素干預(yù)，可逆轉(zhuǎn)上述變化，提示p300可能參與心房肌細(xì)胞電重塑的病理過程。既往研究表明，姜黃素具有雙向劑量反應(yīng)，低劑量姜黃素具有明顯的抗炎、抗衰老作用，高濃度姜黃素反而促進(jìn)細(xì)胞衰老[18]。在本研究亦發(fā)現(xiàn)，兩種不同劑量的姜黃素都能延長老齡小鼠心房肌細(xì)胞ICa,L，低劑量組優(yōu)于高劑量組，提示低劑量的姜黃素可能可以更好的改善衰老所致心房電重塑。姜黃素可減少快速心房起搏誘導(dǎo)老年小鼠的房顫發(fā)生率，提示拮抗p300可能是潛在的衰老導(dǎo)致房顫的治療靶點。

因此，本研究證實了p300在衰老相關(guān)心房肌電重塑中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)增加可導(dǎo)致心房組織衰老信號通路的激活，以及心房肌細(xì)胞的電重塑，最終發(fā)生房顫。