尤鴻美，王 凌，卜芳田，孟宏武，潘雪銀，張亞飛，王 傲，黃 成，李 俊

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,炎癥免疫性疾病安徽省實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032)

1 研究背景

肝纖維化是指當(dāng)肝臟受到持續(xù)性慢性刺激后，以Ⅰ型膠原占據(jù)主導(dǎo)的肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積在肝實(shí)質(zhì)，最終導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)紊亂的可逆性瘢痕修復(fù)過程[1]。病毒性和自身免疫性肝炎、飲酒、非酒精性脂肪性肝炎，導(dǎo)致銅或鐵超載的代謝性疾病，毒素和膽道阻塞等是致使肝纖維化發(fā)生的常見病因。在肝臟中，活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)、門脈成纖維細(xì)胞、骨髓來源的肌成纖維細(xì)胞前體以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后的肝細(xì)胞等均是細(xì)胞外基質(zhì)的生產(chǎn)細(xì)胞，其中活化的HSCs是生產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的主要驅(qū)動(dòng)力[2]。在正常生理?xiàng)l件下，HSCs處于靜息狀態(tài)，僅占肝臟總細(xì)胞數(shù)的5%-8%，存在于竇周間隙中并儲(chǔ)存大量脂滴和維生素A，而當(dāng)肝臟受到持續(xù)性慢性刺激時(shí)，損傷的肝細(xì)胞和定居在肝臟內(nèi)的枯否細(xì)胞釋放炎癥因子誘導(dǎo)HSCs活化并分化為α-SMA陽性的肌成纖維樣細(xì)胞。激活的HSCs會(huì)產(chǎn)生包括Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖連蛋白以及層黏連蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)成分，最終沉積在局部組織損傷部位。其中，竇周間隙過量的ECM會(huì)形成肝細(xì)胞與肝竇腔之間的一道物理屏障，導(dǎo)致肝細(xì)胞血流量減少，肝功能下降，進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化，而目前肝臟移植手術(shù)是針對(duì)肝硬化的唯一治療手段，卻又局限于其并發(fā)癥以及供體的缺乏。因此，現(xiàn)階段，在肝纖維化尚未發(fā)展致肝硬化之前采取有效措施來逆轉(zhuǎn)肝纖維化是唯一可靠的治療方案。

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約22-25個(gè)核苷酸的單鏈RNA，由內(nèi)源性發(fā)夾狀轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生[3]。MiRNAs主要通過靶向mRNA的3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)來抑制mRNA翻譯或促進(jìn)其降解從而發(fā)揮調(diào)控生理和發(fā)育過程等作用[4]，因此其自身的表達(dá)必須要受到嚴(yán)格精密的調(diào)控才能保證正常的細(xì)胞功能。MiRNAs表達(dá)譜的變化對(duì)多個(gè)生物過程有較大影響，如細(xì)胞分化、凋亡、代謝、以及內(nèi)分泌等。而且miRNAs的異常表達(dá)常伴隨有癌癥、心臟疾病、肝臟疾病、腎臟疾病等病理的過程發(fā)生及發(fā)展。因此，miRNAs作為預(yù)后指標(biāo)以及診斷標(biāo)志物的潛在作用已被越來越多的研究和認(rèn)識(shí)。本篇綜述主要意在總結(jié)目前關(guān)于miRNAs調(diào)控HSCs活化與增殖在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其作為治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物的潛在作用。

2 肝纖維化的發(fā)病機(jī)理

肝纖維化是一種由各種損傷因素持續(xù)作用在肝臟所引發(fā)的可逆轉(zhuǎn)的瘢痕修復(fù)反應(yīng)，其主要特征為ECM的過度沉積。如果患者沒有得到及時(shí)有效的治療，肝纖維化會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化，并伴隨有一系列并發(fā)癥，如肝功能喪失、門靜脈高壓、腹水、肝性腦病甚至肝細(xì)胞癌，因此肝纖維化已經(jīng)成為全球重大衛(wèi)生負(fù)擔(dān)之一[5]。當(dāng)明確致病因素時(shí)，一些抗病毒藥物或免疫抑制劑可預(yù)防或減輕部分患者的肝纖維化，然而多數(shù)患者缺乏有效的治療方法，最終導(dǎo)致肝硬化以及預(yù)后不良。肝纖維化的進(jìn)展與細(xì)胞外基質(zhì)的數(shù)量和成分密切相關(guān)，在正常肝臟中，細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)量在合成與降解之間有著精密的調(diào)節(jié)，處于高度動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而在慢性肝損傷的過程中，合成的細(xì)胞外基質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過降解部分，并且其成分的改變也直接導(dǎo)致了肝纖維化的產(chǎn)生。健康肝臟中，ECM僅占肝臟組織切片相對(duì)面積的3%以及大約0.5%濕重，纖維化晚期階段的肝臟含有比正常健康肝臟多6倍的細(xì)胞外基質(zhì)，主要成分包括Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、波狀蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等。而增生性的肌成纖維細(xì)胞是過量ECM的主要細(xì)胞來源[6]，例如，在肝、腎、肺等器官的慢性纖維增生性疾病中，肌成纖維細(xì)胞的存在是這類疾病重要的共同特征，它是一種收縮性極強(qiáng)的纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞，通常由間充質(zhì)細(xì)胞系轉(zhuǎn)分化而產(chǎn)生，這一過程成為“活化”。血小板衍生生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等旁分泌因子和別的一些生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子等均會(huì)激活細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌的信號(hào)通路，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化“活化”。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞群，如組織定居或骨髓來源的成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、上皮細(xì)胞等均可以轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化及膽管結(jié)扎導(dǎo)致的小鼠肝纖維化模型中，82%-96%的肌成纖維細(xì)胞均來自于HSCs的活化[7]，也就是說活化的HSCs是肝內(nèi)ECM的主要生產(chǎn)細(xì)胞。因此抑制HSCs的活化并誘導(dǎo)凋亡是治療肝纖維化的關(guān)鍵[8]。20世紀(jì)70年代的早期臨床報(bào)告表明晚期的肝纖維化也是可逆的，之后的大量研究進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)肝纖維化的消退伴隨有HSCs的凋亡、老化或轉(zhuǎn)分化為失活態(tài)以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解。綜上所述，在肝纖維化的治療過程中，將HSCs作為治療靶標(biāo)，抑制其活化增殖，促進(jìn)活化HSCs凋亡及衰老或誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為失活的狀態(tài)來減少活化HSCs數(shù)量和ECMs的沉積量是治療肝纖維化的重要手段。

3 MiRNAs的生物合成與作用機(jī)制

MiRNAs 是一類內(nèi)生的，由19-24個(gè)核苷酸組成的短序列非編碼RNA分子，保守性較高。MiRNA 的生物合成過程需要較多步驟的加工程序，首先RNA聚合酶Ⅱ在基因組的不同區(qū)域轉(zhuǎn)錄的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物為幾百個(gè)核苷酸分子長度的原始miRNAs (pri-miRNAs)，pri-miRNAs又在RNaseⅢ家族酶-Drosha的作用下被加工成70nt含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNAs (pre-miRNAs)，其中發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3′端向外突出兩個(gè)核苷酸，一個(gè)為5′磷酸，另一個(gè)為3′羥基，這是RNaseⅢ的經(jīng)典產(chǎn)物，隨后輸出蛋白-5識(shí)別到發(fā)夾二核苷酸突出信號(hào)，并將pre-miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNAs的5′磷酸、3′突出以及莖環(huán)部位被RNaseⅢ家族酶-Dicer酶識(shí)別并結(jié)合，Dicer是一種“分子標(biāo)尺”，可以將pre-miRNAs裂解為特定長度的雙鏈miRNA，其中一條鏈最終形成成熟的miRNAs，并與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合形成miRNAs核酸蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用，另一條鏈則被降解。MiRNAs指導(dǎo)RISC于轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)目的基因的表達(dá)有兩種沉默機(jī)制：若mRNA與miRNA可以完全互補(bǔ)，那么該mRNA則會(huì)被RISC特異性降解掉；若兩者不能完全互補(bǔ)，那么mRNA就不會(huì)被降解，RISC則會(huì)阻止mRNA作為翻譯模板從而抑制蛋白質(zhì)的生物合成[9]。

4 MiRNAs在肝纖維化中作用的最新研究

多年研究表明，大量miRNAs通過調(diào)節(jié)HSCs的活化，增殖，凋亡以及衰老等過程而參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展階段，因此通過調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)而調(diào)控HSCs的活化狀態(tài)最終實(shí)現(xiàn)對(duì)肝纖維化的治療作用將為肝纖維化的治療提供新的潛在治療方案。

Fig 1 The regulatory effects of miRNAs on HSCs in progression and reversal of liver fibrosis

4.1 MiRNAs對(duì)HSCs活化及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)正常的健康肝臟中，HSCs處于靜息狀態(tài)，當(dāng)炎癥或慢性刺激損傷肝臟時(shí)，TGF-β及PDGF等炎性細(xì)胞因子會(huì)以自分泌或旁分泌的形式作用于HSCs，進(jìn)而誘導(dǎo)其活化。而HSCs的活化是早期肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心事件，因此，抑制HSCs的活化有利于肝纖維化的逆轉(zhuǎn)恢復(fù)。近期，關(guān)于肝纖維化進(jìn)展中HSCs與miRNAs之間的相互作用相繼被報(bào)道。

大量文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道m(xù)iRNAs與HSCs的活化增殖及相關(guān)通路相關(guān)，Hyun等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-378家族(miR-378a-3p，miR-378b以及miR-378d等)在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型以及TGF-β誘導(dǎo)激活的HSCs中表達(dá)量顯著下降，并且能夠通過靶向轉(zhuǎn)錄因子Gli3抑制HSCs的活化，過表達(dá)miR-378a-3p可減少Gli3和其他促纖維化基因的含量但是HSCs失活指標(biāo)膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)顯著增加。Wei等[11]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)，miR-455-3p在TGF-β誘導(dǎo)的HSCs活化過程中表達(dá)下調(diào)，并且在CCl4，高脂喂養(yǎng)以及膽管結(jié)扎所致的3種小鼠肝纖維化模型中，miR-455-3p表達(dá)水平也明顯降低，進(jìn)一步的功能學(xué)探究發(fā)現(xiàn)miR-455-3p可通過與熱休克蛋白1(Hsp1)的mRNA3′-UTR結(jié)合，抑制Hsp47/TGF-β/smad4信號(hào)通路最終抑制HSCs的活化。Wu等[12]報(bào)道m(xù)iR-194在人肝纖維化組織及激活態(tài)HSCs中表達(dá)含量下降，高水平的miR-194可通過靶向蛋白激酶AKT2來減少HSCs中α-SMA、COL1α1表達(dá)從而致使HSCs失活，以及通過阻滯細(xì)胞周期從而抑制HSCs增殖，減緩肝纖維化進(jìn)程。此外，研究者發(fā)現(xiàn)miR-193a/b-3p在con-A誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中表達(dá)下降，用慢病毒載體系統(tǒng)過表達(dá)miR-193a/b-3p后，小鼠肝纖維化癥狀明顯減輕[13]。MiR-29已被報(bào)道也是在肝纖維化中呈現(xiàn)下調(diào)狀態(tài)并具有抗纖維化功能的小RNA，TGF-β則能通過下調(diào)miR-29并激活HSCs以及促進(jìn)ECM的沉積加重肝纖維化癥狀[14]。Kwiencinski等[15]發(fā)現(xiàn)在活化的HSCs中敲低miR-29可增加血小板衍生生長因子-B、胰島素樣生長因子-Ⅰ等促纖維化基因的表達(dá)。

近幾年，逐漸增多的研究表明，異常表達(dá)的miRNAs水平可能預(yù)示著肝纖維的不良預(yù)后。Ma等[16]通過對(duì)靜息態(tài)和活化態(tài)HSCs進(jìn)行芯片分析，發(fā)現(xiàn)miR-214在活化HSCs中表達(dá)明顯上調(diào)，并且體外過表達(dá)miR-214后發(fā)現(xiàn)HSCs活化增多并且促纖維化基因和ECM等明顯增加，而miR-214發(fā)揮這一效應(yīng)可能是通過抑制Hedgehog信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子Sufu的表達(dá)。為了深入探究其臨床功能，miR-214拮抗劑被注射進(jìn)肝纖維化小鼠中，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-214敲除組小鼠體內(nèi)Sufu表達(dá)增加，肝纖維化癥狀也顯著減輕。You等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-125b在肝纖維化進(jìn)展期其含量在活化HSCs而非肝細(xì)胞中明顯上調(diào)，體內(nèi)外抑制miR-125b后，導(dǎo)致HSCs活化被抑制，肝纖維化進(jìn)程也被顯著延緩，深入進(jìn)行機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可能是通過直接靶向Stard13來增強(qiáng)RhoA的活性，最終增加α-SMA表達(dá)水平和HSCs收縮性能。

4.2 MiRNAs對(duì)HSCs增殖及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)研究發(fā)現(xiàn)HSCs增殖與miRNAs之間有著密不可分的關(guān)系，何等[18]報(bào)道m(xù)iR-146a的表達(dá)在不同濃度TGF-β刺激的HSCs中呈現(xiàn)劑量依賴性下調(diào)，而當(dāng)向HSCs中轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后，TGF-β誘導(dǎo)的HSCs的增殖則被明顯抑制。Du等[19]報(bào)道Wnt1和Wnt5a是miR-146a-5p的直接靶點(diǎn)，miR-146a-5p可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制HSCs增殖和膠原沉積等。Ju等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在con-A誘導(dǎo)的肝纖維化模型中miR-193a/b-3p表達(dá)下調(diào)，相關(guān)的機(jī)制研究表明miR-193a/b-3p可以通過直接靶向CAPRIN1和TGF-β2，抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1及Cyclin E1的表達(dá)，從而抑制HSCs的增殖，肝纖維化癥狀減輕。MiR-126*在活化的HSCs中含量明顯下降，過表達(dá)miR-126*后，可明顯抑制TGF-β誘導(dǎo)的HSCs增殖并伴隨血管內(nèi)皮因子的表達(dá)下調(diào)[20]。在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，miR-30a在原代HSCs中表達(dá)明顯下降，過表達(dá)miR-30a則可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，使HSCs活化和增殖減少，α-SMA、COL1α1表達(dá)下降。Qi等[21]報(bào)道，miR-9a-3p在HSCs中過表達(dá)可明顯降低其潛在靶基因Sirt1的表達(dá)，上調(diào)miR-9a-3p可促進(jìn)HSCs的增殖，遷移以及活化。Sun等[22]報(bào)道在TGF-β1誘導(dǎo)的活化HSCs以及CCl4誘導(dǎo)的小鼠纖維化肝臟中，miR-200a表達(dá)水平下調(diào)。進(jìn)一步的研究表明miR-200a，可通過靶向TGF-β2和β-catenin，來抑制TGF-β和wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制HSCs增殖，減緩肝纖維化進(jìn)程。

4.3 MiRNAs對(duì)HSCs凋亡及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)HSCs凋亡常常發(fā)生在肝纖維化逆轉(zhuǎn)階段，因此促進(jìn)HSCs的凋亡將有助于肝纖維化病理的恢復(fù)。Ogawa等[23]報(bào)道m(xù)iR-222在人類肝纖維化進(jìn)程中表達(dá)量增加，并且在LX-2細(xì)胞中，miR-222的表達(dá)與α-SMA，COL1α1呈現(xiàn)相同趨勢，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-222可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑-1B(CDKN1B)的3′UTR區(qū)結(jié)合，抑制下游靶蛋白，促進(jìn)表達(dá)NF-κB，最終抑制HSCs的凋亡。Dai等[24]報(bào)道m(xù)iR-155在肝硬化患者的血清和肝臟組織以及活化HSCs中含量下調(diào)，在體外實(shí)驗(yàn)中，增加miR-155含量后可顯著抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1信號(hào)通路并誘導(dǎo)HSCs凋亡。Chen等[25]報(bào)道在肝纖維化進(jìn)展中，miR-150-5p呈現(xiàn)出細(xì)胞特異性表達(dá)模式，即在肝細(xì)胞中表達(dá)升高，但是在HSCs中表達(dá)下降。過表達(dá)miR-150-5p可促進(jìn)HSCs凋亡，而干擾素信號(hào)通路的介入可能是miR-150-5p誘導(dǎo)HSCs凋亡的機(jī)制之一。

在HSCs內(nèi)促凋亡基因BAX和抗凋亡基因BCL2表達(dá)量的失衡，是致使HSCs凋亡的重要因素。Niu等[26]報(bào)道m(xù)iR-1273g-3p在丙型肝炎病毒導(dǎo)致的肝纖維化病人的血清及肝組織中含量顯著升高，當(dāng)向LX-2中轉(zhuǎn)染miR-1273g-3p模擬物時(shí)，細(xì)胞凋亡被明顯抑制，同時(shí)細(xì)胞增殖也明顯增加，而當(dāng)miR-1273g-3p被抑制時(shí)，促凋亡基因BAX，BAD，cl-caspases3，cl-caspases9等表達(dá)水平升高，但是抗凋亡基因BCL-2表達(dá)水平下降，結(jié)果表明抑制miR-1273g-3p可促進(jìn)HSCs凋亡進(jìn)而阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程。進(jìn)一步的下游靶標(biāo)探究發(fā)現(xiàn)miR-1273g-3p可能是通過PTEN/AKT信號(hào)通路來發(fā)揮抗纖維化作用，這一研究為肝纖維化的治療提供了新的途徑。

4.4 MiRNAs對(duì)HSCs衰老及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的多數(shù)細(xì)胞都要經(jīng)歷分化、去分化、衰老、死亡等過程，其中衰老是多種刺激因素引起的細(xì)胞反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)時(shí)，其形態(tài)會(huì)發(fā)生較大變化，失去進(jìn)入細(xì)胞周期的能力，并停滯再G0/G1期，增殖能力顯著降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞永久性生長停滯[27]，而當(dāng)活化的HSCs停止增殖進(jìn)入衰老狀態(tài)以后，ECM分泌明顯減少并且ECM降解酶的水平顯著增加。Kong等[28]研究表明，通過誘導(dǎo)HSCs衰老，肝纖維化病理進(jìn)程明顯緩解。楊俊發(fā)等[29]在實(shí)驗(yàn)中探究發(fā)現(xiàn)miR-145在小鼠肝纖維化組織以及活化的HSCs中表達(dá)均表現(xiàn)為下調(diào)趨勢，p53作為經(jīng)典的細(xì)胞衰老調(diào)控基因，當(dāng)其缺失時(shí)，HSCs衰老減少，最終導(dǎo)致肝纖維化惡化情況，而p53啟動(dòng)子可以被ZEB1/2調(diào)節(jié)，因此楊等[29]研究發(fā)現(xiàn)miR-145可通過靶向ZEB2以p53依賴性方式促進(jìn)活化的HSCs衰老，最終減輕肝纖維化進(jìn)程，該發(fā)現(xiàn)可能為臨床肝纖維化的治療提供一種新的治療方案。

5 結(jié)論及展望

慢性病毒和代謝紊亂、酒精濫用等因素引起的進(jìn)行性肝纖維化疾病平均每年可導(dǎo)致100萬人死于肝硬化，但針對(duì)抗纖維化的藥物迄今為止尚未被研究出世?；罨腍SCs是分泌細(xì)胞外基質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞的主要細(xì)胞來源，而HSCs的活化、增殖和凋亡以及老化是肝纖維化發(fā)生和緩解的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，對(duì)HSCs進(jìn)行細(xì)胞靶向藥物治療將成為治療肝纖維化的重要手段。大量miRNAs對(duì)HSCs的生物學(xué)功能調(diào)控的研究證實(shí)，部分miRNAs表達(dá)譜對(duì)HSCs的活化、增殖和凋亡及衰老等具有靶向調(diào)控作用，從而促進(jìn)或減緩肝纖維化進(jìn)程，表明miRNAs對(duì)于肝纖維化的預(yù)防、診斷、治療及預(yù)后等具有較大的潛力，并可能作為未來藥物治療的靶點(diǎn)，具有非常廣闊的研究前景。