王華晶，姜廷良，李滄海

(中國中醫(yī)科學院 1.青蒿素研究中心、2.中藥研究所唐氏中藥研究中心，北京 100700)

青蒿素的低毒性與強大的抗瘧活性，使其從上市以來一直是抗瘧治療的一線藥物。由于瘧原蟲(plasmodium)對氯喹(chloroquine)、奎寧(quinine)等單一化學抗瘧藥物的敏感性逐漸降低，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦了以青蒿素及其衍生物為基礎與其它抗瘧藥配伍使用的青蒿素聯(lián)合療法,簡稱為ACT療法(artemisinin-based combination therap，ACTs)，一般用藥三日就可達到治療效果，該方法可顯著降低瘧疾的死亡率[1]。

近些年，東南亞一些國家尤其是柬埔寨相繼出現(xiàn)了經(jīng)ACTs三日治療以后，血液內(nèi)仍存有瘧原蟲的病例。也就是瘧原蟲的清除時間延長，導致世衛(wèi)組織在2005年的《全球耐藥性報告》中對可能存在的青蒿素耐藥性提出了擔憂[2]。2007年，在柬埔寨拜林地區(qū)進行了一項研究，單用青蒿琥酯或采用青蒿琥酯與甲氟喹聯(lián)用治療瘧疾患者，發(fā)現(xiàn)這兩種治療方法都會引起瘧疾患者血液內(nèi)的瘧原蟲清除時間延長。因此，提出了瘧原蟲對青蒿素類藥物產(chǎn)生了耐藥性。青蒿素耐藥性的最新定義是[3]：青蒿琥酯單藥治療或ACTs治療瘧疾患者后，血液中瘧原蟲清除時間延長。但對“延長”機制尚缺乏足夠的科學共識。

研究表明，惡性瘧原蟲13號染色體上的Kelch13編碼基因(K13)的突變與瘧原蟲清除時間延長密切相關，這也被認為是引發(fā)瘧原蟲對青蒿素類藥物產(chǎn)生耐藥性的最主要原因。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在東南亞的泰國、柬埔寨、老撾一些地區(qū)，瘧原蟲清除時間延長伴有K13突變，而在東南亞的緬甸、非洲的尼日利亞、剛果共和國等一些地區(qū)，瘧原蟲清除時間延長不伴有K13突變。即使是同時感染K13突變瘧原蟲的患者，在抗瘧治療過程中，瘧原蟲的清除時間也有很大差異[4]。上述研究提示，K13突變并非患者體內(nèi)瘧原蟲清除時間延長的必要條件。

由于青蒿素及其衍生物的耐藥概念與傳統(tǒng)藥理學的耐藥定義內(nèi)涵不一致，而瘧原蟲體內(nèi)清除速率影響因素不僅與病原體自身改變有關，而且也涉及到宿主機體狀態(tài)和處理能力相關。例如脾臟通過特異性孔蝕功能清除瘧疾患者體內(nèi)的瘧原蟲，在瘧原蟲的清除率中占很大比重，在用青蒿素及其衍生物治療的脾功能正常患者體內(nèi)，這一清除機制顯得尤為重要。而對于脾切除患者，在用青蒿素及其衍生物治療后，瘧原蟲的清除時間會明顯延長，這一現(xiàn)象表明脾臟對于瘧疾患者體內(nèi)的瘧原蟲清除具有重要意義。但是脾臟對瘧原蟲的清除作用與ACTs治療后出現(xiàn)的瘧原蟲清除時間延長即耐藥有無相關性，目前尚不明確。此外，患者感染瘧原蟲后，機體會產(chǎn)生獲得性免疫，免疫細胞產(chǎn)生的抗體可與裂殖子表面抗原結合防止裂殖子入侵紅細胞；免疫因子調節(jié)或中和染蟲紅細胞，促進染蟲紅細胞自身的溶解作用，從而促進瘧原蟲的清除。這些功能主要由細胞色素IgG亞類，IgG1和IgG3介導[5]。同時機體的免疫器官脾臟依賴物理生化、免疫功能等同時發(fā)揮清除瘧原蟲的作用。因此，這里所說的青蒿素耐藥(瘧原蟲的體內(nèi)清除時間延長)與抗瘧藥物對瘧原蟲的殺傷作用、人體免疫細胞的調節(jié)作用、免疫器官的外排異物功能等具有密切關系。故本文就青蒿素耐藥性相關機制研究與脾臟的濾過、免疫功能及脾臟對瘧原蟲的清除機制等進行綜述整理，以期為瘧原蟲對青蒿素耐藥性的研究提供新的思路和參考。

1 瘧原蟲基因突變及青蒿素耐藥

惡性瘧原蟲K13(Pfkelch13)基因突變被認為是瘧原蟲對青蒿素類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

瘧原蟲依賴于消耗染蟲紅細胞內(nèi)的血紅蛋白得以生長與繁殖，在消耗血紅蛋白的過程中會產(chǎn)生一些血紅蛋白降解產(chǎn)物，這些降解產(chǎn)物可激活青蒿素類藥物從而發(fā)揮藥物的殺蟲功效。Birnbaum等[6]發(fā)現(xiàn)Pfkelch13和UBP1、AP-2μ、內(nèi)吞蛋白Eps15等組成與吞噬宿主紅細胞相關的內(nèi)吞區(qū)室。Pfkelch13對于瘧原蟲攝取染蟲紅細胞內(nèi)血紅蛋白至關重要，該蛋白控制內(nèi)吞作用水平，進而影響血紅蛋白降解產(chǎn)物的濃度。如果Pfkelch13發(fā)生變異，血紅蛋白降解產(chǎn)物的濃度降低，導致青蒿素類藥物無法被充分激活并殺死瘧原蟲。

K13蛋白是Kelch類超家族的726個氨基酸成員，具有C末端六葉β-螺旋槳結構域、瘧原蟲特異性N末端結構域和BTB/POZ結構域。雖然在Pfkelch13中鑒定出兩百多種非同義突變，但其中只有9種突變被證實具有體外抗逆轉錄病毒能力(F446I、N458Y/I、M476I/V、Y493H、R539T、I543T、P553L、R561H、C580Y)。在柬埔寨地區(qū)，C580Y、Y493H和R539T的突變最為普遍。在中緬邊境，主要是F446I突變，其次是R539T、P574L、N458Y、R561H和A676D[7]。

2 脾臟結構與功能

脾臟位于機體腹部，在隔膜的正下方，是一個細長的暗紅色器官，被一層纖維膜(支撐較大血管系統(tǒng)的結締組織)包裹[8]，與胃相鄰，是機體最大的血液過濾器，可有效截留并清除血液循環(huán)中的異常紅細胞，對于維持機體正常血液循環(huán)發(fā)揮很重要的作用。也是體內(nèi)最大的次級淋巴器官，負責清除體內(nèi)外來物質和衰老或受損的紅細胞，同時引發(fā)血源性抗原的免疫反應。

脾臟包含紅髓(red pulp，RP)與白髓(white pulp，WP)兩個功能性區(qū)域，嚙齒動物的這兩個區(qū)域通過邊緣區(qū)(marginal zone，MZ)連接，而人類通過濾泡周圍區(qū)(perifollicular zone，PFZ)連接[9-10]。RP占脾臟的大部分，呈海綿狀結構，充滿著流經(jīng)脾靜脈竇(splenic sinus)和髓束(cords)的血液，該區(qū)域的主要功能是過濾血液和保護血液中的鐵循環(huán)。WP占比不到脾臟的25%，卻是脾臟的主要免疫功能區(qū)。

2.1 紅髓的兩條血液循環(huán)通路脾臟無輸入淋巴管，因此所有細胞和抗原通過血液進入脾臟。動脈血通過脾動脈進入脾臟，脾動脈在脾臟有許多的中央小動脈分支，中央小動脈周圍有包含T細胞區(qū)的動脈周圍淋巴鞘(periarteriolar lymphoid sheaths，PALS)。PALS旁邊是B細胞濾泡。PALS和B細胞濾泡一起構成脾臟的WP，WP被邊緣區(qū)包圍，動脈血通過毛細血管進入MZ。進入MZ的80%-90%的血液直接進入脾靜脈竇，經(jīng)過竇后微靜脈，匯入脾靜脈，這條通路稱為快速閉合循環(huán)通路。MZ被濾泡周圍區(qū)域(perifollicular zone，PFZ)包裹，血液流經(jīng)PFZ后，一些血管終止，血液流入由PFZ和RP構成的慢速開放循環(huán)通路[11]。脾臟對血液的濾過作用就在這條通路中的RP中進行。

識別紅細胞的大小、形狀、變形性的改變是脾臟的特異性功能，紅髓巨噬細胞(macrophages，MPs)對紅細胞的這些改變具有高度靈敏性。當血液進入紅髓以后流速減慢，血液會先與MPs、樹突細胞(dendritic cells，DCs)等免疫細胞接觸，MPs識別并攝取病原體和細胞碎片以及衰老的紅細胞等，一些病原體可直接被MPs識別，但許多病原體首先需要經(jīng)過“調理(opsonising)”，在此過程中，病原體表面被補體或其他脾源性調理素(促吞噬素，備解素)包裹，這些分子可與巨噬細胞上的受體相互作用，促使病原體被清除。

Fig 1 Diagram of two blood circulation pathways of spleen[12]

剩余血液要重回血液循環(huán)必須經(jīng)過脾靜脈竇。脾靜脈竇是由內(nèi)皮細胞襯里組成，平行定位并通過應力纖維連接到環(huán)狀纖維，形成一個網(wǎng)狀系統(tǒng)，應力纖維的收縮性允許在內(nèi)皮細胞之間形成間隙，間隙平均長度和寬度分別為1.89 μm和0.65 μm，硬度是毛細血管的10倍[12]。剩余血液成分通過脾靜脈竇的內(nèi)皮細胞間隙返回血管內(nèi)循環(huán)。紅細胞與內(nèi)皮細胞間隙之間不存在配體-受體相互作用，后者通過物理機械傳感方式截留異常紅細胞。紅細胞通過該間隙時，因為壓力，會發(fā)生擠壓變形。正常紅細胞的細胞表面面積變化范圍在80-180 μm2，可變?nèi)莘e范圍在60-160 μm3，具有良好的可變形性及恢復性，通過較窄毛細血管時，會發(fā)生子彈狀的變形，通過內(nèi)皮細胞間隙時會發(fā)生啞鈴狀變形，經(jīng)過這兩種通道后，正常紅細胞都會恢復其原形，且正常功能不會受損。當紅細胞膜表面積缺損程度≥18%，紅細胞表面積/體積比值降低≥27%時，可變形性明顯降低，無法正常通過內(nèi)皮細胞間隙而被截留。正常紅細胞在老化期間會發(fā)生表面積損失和可變形性降低。感染病原體的紅細胞體積腫大，可變性降低而無法通過間隙被截留。

正常紅細胞變形性強，可正常通過間隙并返回靜脈系統(tǒng)。而變形性異常的紅細胞會被截留，通過MPs或DCs的作用被清除。所以，脾臟在維持血液循環(huán)中的紅細胞大小、形態(tài)的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。

被截留的病原體或細胞碎片，被紅髓巨噬細胞識別并清除。紅髓巨噬細胞與血液單核細胞衍生的巨噬細胞相反，主要表達低親和力受體FcγRIIa和FcγRIIIa。不表達抑制性FcγRIIb受體，而表達非常低水平的高親和力受體FcγRI[13]。此外，紅髓巨噬細胞吞噬并溶解異常紅細胞后，可很好的回收來自紅細胞的鐵，促進鐵的再循環(huán)。

2.2 白髓的免疫功能在脾動脈的中央小動脈分支周圍存在T細胞區(qū)(也稱為小動脈周圍淋巴鞘，PALS)和B細胞區(qū)，這兩個區(qū)域共同構成了脾臟的WP。WP是一個淋巴區(qū)域，與淋巴結的結構非常相似，沒有血流，可啟動機體適應性免疫應答。

Fig 2 Splenic sinus

WP的功能與維持由特定的趨化因子控制，在淋巴細胞通過邊緣區(qū)進入白髓時，這些趨化因子將T細胞和B細胞轉移到各自的區(qū)域，從而在白髓中建立特定區(qū)域。CXC趨化因子配體13(CXC-chemokine ligand，CXCL13)將B細胞轉移到B細胞區(qū)，CCL19和CCL21將T細胞和DCs轉移到T細胞區(qū)。而且趨化因子受體及其配體對于T/B細胞區(qū)的細胞濃度至關重要，例如CC趨化因子受體7(CC-chemokine receptor，CCR7)的缺失會導致T細胞散亂的分布在脾臟中[14]。這些趨化因子的表達受淋巴毒素α1β2(LT-α1β2)和腫瘤壞死因子(TNF)的影響。當缺少通過LT-β受體(LT-βR)或TNF受體1(TNFR1)發(fā)出的信號時，脾臟中的穩(wěn)態(tài)趨化因子CXCL13、CCL19和CCL21的水平降低，從而導致WP的解體。LT-βR和TNFR1均由抗輻射基質細胞表達，而它們的配體則由造血細胞表達。這些受體被結合后，核因子κB被激活，從而誘導了各種趨化因子的表達。CXCL13是由CD35 +卵形樹突狀細胞(follicular dendritic cells，F(xiàn)DCs)與FDCs相鄰的基質細胞產(chǎn)生的，它對轉移B細胞到B細胞區(qū)至關重要。T細胞區(qū)中基質細胞和DCs產(chǎn)生的CCL19和CCL21對T細胞的轉移和儲存也至關重要。在T細胞區(qū)的發(fā)育過程中，表達LTα1β2的B細胞是基質細胞充分表達CCL21所必需的[15]。

T/B細胞兩個分區(qū)有利于對外來和自身抗原作出適當?shù)拿庖哒{節(jié)，B細胞遇到外來抗原首先在CXCL13、CCL19和CCL21等一系列趨化因子濃度梯度誘導下遷移至T、B細胞分界處，在該處T細胞的幫助下，B細胞進一步分化或返回B細胞區(qū)。B細胞區(qū)中含有對B細胞活化和存活至關重要的細胞混合物，返回該區(qū)域的B細胞大量增殖和分化，形成B細胞生發(fā)中心(germinal center，GC)，生發(fā)中心是體液免疫應答過程中B細胞大量增殖、選擇、消亡的場所。為響應同源抗原和T-依賴性B細胞生發(fā)中心的反應，脾臟中的幼稚細胞和中央記憶T細胞被激活，從而產(chǎn)生抗體。GC作為體液免疫功能單位，其形成依賴于T/B細胞區(qū)域邊界的完整性[16]。

2.3 邊緣區(qū)的免疫功能WP由先天免疫細胞組成的邊界包裹，這個邊界也稱為邊緣區(qū)(MZ)。邊緣區(qū)域形成了先天性和適應性免疫應答之間的橋梁，MZ含有 MPs、DCs、B細胞輔助中性粒細胞(B cell-helper neutrophils ,NBH)、先天性淋巴細胞3型(innate lymphoid cells type 3，ILC3)、CD4+T淋巴細胞、MZ B細胞和記憶B細胞。該區(qū)域中表達特定模式識別受體的MPs可以有效地攝取血源性病原體。MZ B細胞可以被這些巨噬細胞激活，或者可以直接識別血源性病原體，之后它們變成抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells，APCs)或產(chǎn)生IgM的記憶細胞。IgM記憶B細胞是脾臟邊緣區(qū)特有的細胞群，可產(chǎn)生天然抗體五聚體IgM，這類抗體能夠直接或通過補體沉積在病原體的包膜上促進吞噬，切除脾臟后，機體IgM記憶B細胞減少[17]。

3 脾臟清除瘧原蟲的機制

3.1 免疫清除感染瘧原蟲的紅細胞與脾臟免疫細胞的第一次接觸發(fā)生在邊緣區(qū)[18]，邊緣區(qū)的巨噬細胞和樹突狀細胞，具有攝取外來物質并將其呈遞給輔助性T細胞的能力。由CD11c標記物標記的樹突狀細胞在瘧原蟲進入血液后5 d內(nèi)從脾臟邊緣區(qū)域遷移到CD4+T細胞區(qū)域。在同一時期，樹突狀細胞中激活T細胞所必需的CD40、CD54和CD86共刺激因子明顯上調。這表明，脾臟樹突狀細胞在瘧疾感染早期的脾臟免疫反應階段發(fā)揮重要作用。

在瘧疾感染期間，脾臟對瘧原蟲的過度反應會引起脾腫大。以前的研究表明，脾臟中的巨噬細胞參與免疫反應以對抗瘧疾，在感染期間，脾臟中巨噬細胞的數(shù)量明顯增加，這些巨噬細胞可以清除瘧原蟲或感染瘧原蟲的紅細胞。巨噬細胞的大量聚集引起脾臟腫大，不僅促使感染紅細胞的破裂，還會引發(fā)正常紅細胞的破裂，造成機體的嚴重貧血。髓樣相關蛋白(myeloid-related protein，MRP)8和MRP14由中性粒細胞和單核細胞表達，有研究表明MRP8+和MRP14+巨噬細胞的積累與各種炎癥性疾病相關的病理變化有關，也被稱為炎性巨噬細胞的標志物。Haruka研究感染伯氏瘧原蟲的小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中MRP8和MRP14水平升高；感染瘧原蟲的d 7，小鼠脾臟明顯增大，脾臟組織學分析顯示是瘧色素的沉積和單核細胞的積累引起，組織的免疫組化學染色顯示是MRP8+和MRP14+的巨噬細胞的積累，表明瘧疾期間的脾腫大與MRP8+和MRP14+巨噬細胞的積累有關。

哺乳動物的中性粒細胞存在一類表達TCRαβ組合受體的亞群(5%-8%)。有研究表明，感染伯氏瘧原蟲ANKA株的小鼠，在感染的早期階段誘導脾臟中表達TCRβ的CD11b+Ly6G+中性粒細胞擴增。在感染后的d 3，表達TCRβ的中性粒細胞的比例與外周血的染蟲比例具有顯著相關性。此外，TCRβ+中性粒細胞吞噬染蟲紅細胞的效率比TCRβ-中性粒細胞高4倍。提示脾臟的中性粒細胞通過TCRβ表達，增強吞噬能力以影響瘧原蟲的感染率[19]。

3.2 孔蝕清除

3.2.1孔蝕的定義 早先發(fā)現(xiàn)脾臟可通過物理方式截留瘧原蟲，Schnitzer等1972年研究感染諾氏瘧原蟲(Plasmodiumknowlesi，Pk)的猴子，在未給藥的情況下，利用電鏡技術觀察感染猴的脾臟切片，發(fā)現(xiàn)脾臟中有一部分染蟲紅細胞(iRBCs)從髓束通過靜脈竇壁進入竇腔的過程中發(fā)生擠壓變形，iRBCs的不含瘧原蟲的部分進入竇腔，含瘧原蟲的部分被截留在髓束，兩者通過一條細長的莖條狀物質連接。因為壓力，連接兩者的莖條容易斷裂，斷裂以后，截留在髓束的染蟲部分被巨噬細胞吞噬；進入竇腔的部分恢復成“紅細胞”，這種細胞被稱為“曾經(jīng)染蟲紅細胞”(O-iRBCs，也有稱為含有環(huán)狀期感染紅細胞表面抗原的RESA-RBCs，本文均以前者名統(tǒng)稱)，并將這一過程稱為“孔蝕(pitting)”，提出脾臟通過孔蝕清除血液中的瘧原蟲[20]。以后一些學者進一步佐證了Schnitzer等的發(fā)現(xiàn)，將“孔蝕”明確表述為：感染瘧原蟲的紅細胞從髓束穿過靜脈竇壁進入竇腔的過程中，紅細胞內(nèi)的瘧原蟲被截留而不破壞紅細胞的形態(tài)，被感染過的紅細胞可重新返回血液循環(huán)。

同時巨噬細胞和樹突細胞的異質群體在紅髓內(nèi)形成吞噬網(wǎng)絡，負責瘧原蟲殘余物的清除工作。

3.2.2孔蝕的檢測 在惡性瘧原蟲的裂殖子中存在一種顆粒，這些顆粒在裂殖子侵入紅細胞以后被釋放，并且沉積在染蟲紅細胞的細胞膜中，該顆粒被稱為環(huán)狀體感染的紅細胞表面抗原(ring erythrocyte surface antigen，RESA)。RESA在瘧原蟲侵入紅細胞以后，固定表達在紅細胞膜表面，可充當瘧原蟲感染紅細胞的足跡。

在人體脾臟的紅髓，惡性瘧原蟲被擠出iRBCs以后，O-iRBCs會進入血液循環(huán)。利用瘧原蟲DNA與RESA雙染色法區(qū)分iRBCs(RESA陽性、DNA陽性)與O-iRBCs(RESA陽性、DNA陰性)，只有正常瘧疾患者的血液涂片中能觀察到RESA陽性DNA陰性的紅細胞，在惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)與脾切除患者的血液涂片中未發(fā)現(xiàn)RESA陽性DNA陰性的紅細胞[21]。利用這種標記方法，可以更有效研究脾臟的孔蝕發(fā)生率。尤其是抗瘧治療前后或不同藥物治療后，孔蝕發(fā)生率之間的差異。

綜上所述，骨關節(jié)結核在發(fā)生與發(fā)展的過程中，伴隨著機體內(nèi)多種細胞因子表達水平的變化，IL-15、MCP-1和TGF-β含量顯著增高，提示其可能參與骨關節(jié)結核的免疫調節(jié)過程，但其具體機制尚未明確，有待深入研究。IL-15、MCP-1和TGF-β的表達水平有望成為骨關節(jié)結核的預防、診斷、病情監(jiān)測及判斷預后的重要臨床參考指標。

但現(xiàn)階段，只確證了惡性瘧原蟲固定表達在人體iRBCs膜上的蛋白，伯氏、約氏等其他種類瘧原蟲固定表達在iRBCs膜上的蛋白還有待進一步研究。

4 影響孔蝕的因素

眾多實驗表明，脾臟的孔蝕與瘧原蟲的生長周期、染蟲紅細胞膜的剛性(或稱可變形性、柔韌度)、粘附性、滲透性、抗原性、微結構以及使用的抗瘧藥物有關。

4.1 瘧原蟲生長周期感染瘧原蟲的紅細胞預先暴露于青蒿琥酯致死劑量中8-12 h，離體灌注人體脾臟。組織學分析發(fā)現(xiàn)不同的截留形式：① 環(huán)狀體期的瘧原蟲被完全擠出iRBCs，宿主紅細胞可進入脾靜脈；② 早期滋養(yǎng)體的瘧原蟲一部分被擠出iRBCs，其余部分通過絲狀或啞鈴狀仍與其宿主紅細胞相連，但宿主紅細胞已經(jīng)發(fā)生擠壓變形并通過了內(nèi)皮細胞間隙。③ 晚期滋養(yǎng)體期iRBCs的柔韌性喪失，在通過內(nèi)皮細胞間隙時，紅細胞破裂或完全被截留。④ 裂殖體期的iRBCs被完全截留在紅髓。

這一現(xiàn)象與瘧原蟲的生長周期有關。惡性瘧原蟲裂殖子侵入紅細胞以后，在iRBCs中形成的液泡中經(jīng)過環(huán)、滋養(yǎng)體及裂殖體期的變形階段，最終紅細胞破裂釋放16-32個裂殖子。此循環(huán)需要48 h，在這個變化過程中，宿主紅細胞的體積、柔韌性、粘附性和營養(yǎng)物質滲透性也會隨之變化[22]。

4.1.1環(huán)狀體期 環(huán)狀瘧原蟲為單核，在iRBCs內(nèi)呈變形蟲形態(tài)，瘧原蟲體積<10 μm3，完全被iRBCs細胞質所包圍，瘧原蟲與iRBCs之間沒有聯(lián)系膜，iRBCs的體積為92.6±5.1 μm3，此時iRBC細胞膜的柔韌性沒有明顯變化。

4.1.2滋養(yǎng)體期 滋養(yǎng)體階段瘧原蟲擴大并變圓，iRBCs的表面變得不規(guī)則，瘧原蟲的細胞體和細胞核增大膨脹，在瘧原蟲的細胞質中形成含有血紅蛋白晶體的消化液泡，扁平的頂質體存在于細胞核和消化液泡之間的線粒體附近，瘧原蟲體積≥10 μm3。同時染蟲紅細胞的表面開始出現(xiàn)突起(Knobs)，這個突起是由Var多基因家族轉錄而成，在iRBCs的膜表面表達的一類高分子量、具有抗原多樣性、由瘧原蟲編碼的惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白(PfEMP1；一個蛋白質家族的簡稱，含有多種略有差異的蛋白質群)，不同結構的PfEMP1可以和不同的宿主受體結合，主要有CD36、細胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)或血管內(nèi)皮細胞。iRBCs的粘附性是在感染瘧原蟲的16 h后出現(xiàn)，瘧原蟲是在滋養(yǎng)體期開始表達PfEMP1，這也可以解釋iRBCs的粘附性與PfEMP1的調節(jié)有關。瘧原蟲編碼的骨架結合蛋白1(SBP1)，是一種跨膜蛋白，位于瘧原蟲誘導的染蟲紅細胞細胞質內(nèi)的Maurer′s 裂縫(MCs；國內(nèi)將它稱為“茂氏裂縫”或“茂氏裂”)，該蛋白參與PfEMP1在紅細胞表面的表達過程，這在染蟲紅細胞表達粘附性的過程中至關重要。單圓盤形的膜形結構(Maurer′s裂縫)分散存在于紅細胞的細胞質中，但是不直接接觸iRBCs膜和瘧原蟲液泡膜。iRBCs的體積為104.8±9.1 μm3。此時，iRBCs細胞的剛性增加。

在晚期滋養(yǎng)體階段，iRBCs的體積進一步增大，由于瘧原蟲攝取了大量紅細胞的營養(yǎng)物質，紅細胞細胞質的體積會減小，瘧原蟲出現(xiàn)多個未分裂的核體，在消化液泡中會出現(xiàn)成簇的血紅蛋白晶體。iRBCs膜表面的突起仍然存在，數(shù)量要比早期滋養(yǎng)體階段多。而Maurer′s裂縫的數(shù)量逐漸較少。

4.1.3裂殖體期 在裂殖體階段，瘧原蟲是多核且分裂的。瘧原蟲占據(jù)了iRBCs體積的大部分，在iRBCs表面有突出的球形突起，瘧原蟲的頂質體、線粒體也已完成復制，平分到每個裂殖子中。消化液泡被裂殖子包圍，iRBCs的體積為101.1±8.5 μm3。此時的iRBCs已經(jīng)完全失去其原生形態(tài)。

脾靜脈竇的內(nèi)皮細胞間隙平均長度和寬度分別為1.89 μm和0.65 μm。瘧原蟲自身柔韌性很差，一般無法正常通過內(nèi)皮細胞間隙。正常紅細胞具有典型的雙凹圓盤形[23]，具有很強的柔韌性。瘧原蟲處于早期環(huán)狀體階段時，iRBCs的形狀和柔韌性與正常紅細胞無明顯差異，在經(jīng)過脾靜脈竇壁時，iRBCs內(nèi)的瘧原蟲被擠出，O-iRBCs返回血液循環(huán)；隨著瘧原蟲的發(fā)育，紅細胞的雙凹狀逐漸變?yōu)榍驙頪24]，iRBCs的體積、剛性增加，可通過脾靜脈竇內(nèi)皮細胞間隙的iRBCs逐漸減少，滋養(yǎng)體、裂殖體更容易被脾臟隔離。由此可知孔蝕一般是發(fā)生在瘧原蟲的環(huán)狀體時期[25]。

環(huán)狀階段的iRBCs沒有粘附性，滋養(yǎng)體、裂殖體階段的 iRBC的剛性和粘附性增加導致微血管系統(tǒng)的血液動力學阻力增加，這在瘧疾的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

4.2 青蒿素類藥物已有研究資料提示，不同抗瘧藥物對不同類型的瘧原蟲(如惡性瘧、間日瘧)對脾清除染蟲紅細胞，具有不同影響。就孔蝕的作用而論，Wojnarski[26]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，口服以蒿甲醚-苯芴醇或雙氫青蒿素-哌喹的復合療法(ACT)的患者，孔蝕檢出率高達55.8%，使用奎寧、甲氟喹、阿托伐醌-氯脈等非青蒿素類藥物的孔蝕檢出率均低于10%，認為青蒿素類藥物在清除iRBCs過程中，具有孔蝕依賴性。

Chotivanich等[27]探討青蒿琥酯和奎寧治療急性瘧疾患者血液中的瘧原蟲清除機制，發(fā)現(xiàn)兩者既不降低iRBCs的可變形性，也不增加其抗體結合力，而且可提高孔蝕的發(fā)生率：在無并發(fā)癥的瘧疾患者接受青蒿琥酯治療的24 h內(nèi)，O-iRBCs數(shù)量顯著升高，用奎寧治療患者體內(nèi)的O-iRBCs數(shù)量升高非常緩慢(7 d)；在重癥患者，接受青蒿琥酯治療的數(shù)小時內(nèi)O-iRBCs數(shù)量顯著升高，接受奎寧的并不呈現(xiàn)。對于單純性瘧疾和兒童瘧疾患者，青蒿琥酯治療組的孔蝕發(fā)生率也大于奎寧治療組。對于這一現(xiàn)象的推測可能是孔蝕主要發(fā)生在瘧原蟲的環(huán)狀體時期，青蒿素類藥物作用于瘧原蟲生長過程中的每個階段，像奎寧、甲氟喹等非青蒿素類藥物，主要是作用于瘧原蟲生長過程中的成熟階段，對環(huán)狀體時期的瘧原蟲藥效不大。氯喹還可增加iRBC的剛性，降低iRBC在內(nèi)皮細胞間隙的通過率。因此青蒿素類藥物對孔蝕的影響更明顯。

此外，嚴重瘧疾患者出現(xiàn)的延遲性貧血與孔蝕發(fā)生率有關。嚴重的瘧疾患者進行抗瘧治療時，紅細胞大量死亡，一般在7 d以內(nèi)會有貧血現(xiàn)象，表現(xiàn)為血紅蛋白降低10%以上，延遲性貧血是指血紅蛋白值的這個降低過程發(fā)生在開始治療8 d后。統(tǒng)計分析這些病例，發(fā)現(xiàn)這些病例中，用青蒿琥酯進行治療的患者居多，在21名用青蒿琥酯治療的嚴重瘧疾患者中有12名患者發(fā)生延遲性貧血，而且孔蝕率越高，患者更容易出現(xiàn)延遲性貧血。因此提出了青蒿琥酯會引發(fā)嚴重瘧疾患者的延遲性貧血。對于這一現(xiàn)象的推測是，青蒿素類藥物會升高孔蝕的發(fā)生率，使得更多的O-iRBCs返回血液循環(huán)，但是這些紅細胞的細胞膜已經(jīng)是受損的狀態(tài)，利用高速成像流式細胞儀記錄并分析正常RBCs、iRBCs和O-iRBCs的表面積發(fā)現(xiàn)，iRBCs的表面積大約是正常RBCs表面積的97.1%，O-iRBCs的表面積是正常RBCs表面積的91.1%，返回血液循環(huán)的O-iRBCs因為細胞膜受損嚴重，細胞內(nèi)的血紅蛋白等營養(yǎng)物質會外漏，壽命要比正常RBCs大幅縮短(正常RBCs平均壽命為1 027 h，O-iRBCs的平均壽命為183 h)，雖然嚴重瘧疾患者在用青蒿琥酯治療初期不會發(fā)生貧血，但是8 d后，返回血液循環(huán)的O-iRBCs會大量死亡，所以貧血現(xiàn)象會延遲[28]。

一般認為，血液循環(huán)中的感染瘧原蟲的紅細胞通過脾臟和吞噬細胞兩大系統(tǒng)進行消除。Aogo等[29]通過伯氏瘧原蟲感染小鼠以及用氯屈膦酸鹽脂質體耗竭吞噬細胞系統(tǒng)等實驗，認為兩大系統(tǒng)在清除血流中染蟲紅細胞的作用大體各占一半；而青蒿琥酯的作用主要抑制瘧原蟲的復制，對誘導清除的作用似乎不大。

綜之，由于相關研究尚待深入，目前依然存在人類脾臟在瘧疾中的作用是“過濾器”還是“庇護所”的不同議論[30]。但從已有臨床和實驗結果來看，脾臟通過免疫和物理等途徑，在消除紅細胞內(nèi)的瘧原蟲上起著相當重要的角色。至于被截留在脾內(nèi)的裂殖體和配子母細胞成為復燃的種子，尚缺乏足夠事實依據(jù)。

5 小結與展望

ACTs三日療法是瘧疾的一線治療方法，但近年出現(xiàn)ACTs治療3 d后，血液內(nèi)仍存有瘧原蟲的病例報道，由此提出把血液中瘧原蟲清除時間延長判斷為瘧原蟲對青蒿素類藥物產(chǎn)生了耐藥性。但現(xiàn)階段對“延長”機制尚缺乏足夠的科學共識，揭示“清除時間延長”的真諦，有助于澄清對青蒿素耐藥性問題的異議。瘧原蟲的體內(nèi)清除速率不僅與瘧原蟲本身的變異、與抗瘧藥物的作用機制有關，還受人體免疫和吞噬細胞的調節(jié)作用、免疫器官的外排異物等功能的影響。其中人體最大的血液過濾器及次級淋巴器官脾臟就參與了機體清除瘧原蟲的工作。

脾臟通過特異性孔蝕這一物理過程截留血液中的瘧原蟲，結合紅髓中免疫細胞特異性吞噬瘧原蟲和紅細胞碎片這一生化過程加速清除血液中的瘧原蟲?？孜g主要發(fā)生在瘧原蟲的環(huán)狀體時期，處于滋養(yǎng)體期和裂殖體期的染蟲紅細胞會被完全截留在紅髓中。青蒿素類藥物作用于紅內(nèi)期瘧原蟲生長過程中的每個階段，而非青蒿素類藥物主要是作用于瘧原蟲生長過程中的成熟階段，所以青蒿素類藥物對孔蝕發(fā)生率的影響更大。

脾臟的血液濾過功能在機體清除瘧原蟲的過程中產(chǎn)生多大的貢獻，還無法判斷。脾臟紅髓中的免疫細胞對被截留的染蟲紅細胞或瘧原蟲的識別方式，配體-受體的結合方式仍不清楚。截留在紅髓中的瘧原蟲還有無復染的可能、瘧原蟲的“青蒿素耐藥”這一說法與脾切除后引起的瘧原蟲清除時間延長之間的相關性有待進一步研究。青蒿素自身對脾臟功能有無影響，脾靜脈竇的內(nèi)皮細胞間隙在病理狀態(tài)下的血液濾過機制如何改變還不清楚。研究這些問題可為了解脾臟清除瘧原蟲機制、脾臟對抗瘧藥物抗瘧作用的貢獻度提供科研基礎；同時，也可為另一些以紅細胞為寄主的其他人畜共患的病原體如牛羊的邊蟲病、犬巴貝斯蟲病等的消除，提供借鑒。