路俊仙,郭瑞齊,林慧彬
(山東省中醫(yī)藥研究院,山東 濟(jì)南 250014)
西洋參為五加科植物西洋參(Panax quinquefolium L.)的干燥根,原產(chǎn)于加拿大和美國(guó),我國(guó)始載于清朝汪昂《補(bǔ)圖本草備要》。西洋參能養(yǎng)陰潤(rùn)肺,清心安神,有人參的補(bǔ)性而無(wú)人參的燥性[1],是藥食兩用的名貴補(bǔ)品。市場(chǎng)需求量一直較大,但價(jià)格始終居高不下。其原因在于:西洋參種植周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低[2];生產(chǎn)中依靠種子繁育種苗卻受限于種子產(chǎn)量低及其嚴(yán)重的后熟現(xiàn)象[3],造成栽培用實(shí)生苗供應(yīng)不足,限制其種植面積的擴(kuò)增,進(jìn)而制約西洋參總產(chǎn)的提高。
組織培養(yǎng)技術(shù)通過(guò)植物離體細(xì)胞、組織、器官等在培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織或者進(jìn)一步分化長(zhǎng)成新植株,不受環(huán)境、氣候、病蟲(chóng)害影響,可實(shí)現(xiàn)全年穩(wěn)定生產(chǎn),還可通過(guò)優(yōu)良品種篩選、細(xì)胞株篩選、冠癭組織培養(yǎng)加快目標(biāo)產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化、提高得率[4,5]。目前西洋參組織培養(yǎng)研究多集中于利用冠癭組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物及外植體誘導(dǎo)愈傷組織,大規(guī)模生物發(fā)生器擴(kuò)大研究較少,西洋參成功分化再生植株和育種的研究也很少。一方面急需建立西洋參細(xì)胞、冠癭組織和毛狀根的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)體系,提取西洋參藥效成分;另一方面需建立成熟穩(wěn)定的西洋參快繁體系,大規(guī)模快速繁殖西洋參種苗并培育新品種,擺脫自然環(huán)境條件的限制,滿(mǎn)足栽培需求,解決西洋參供求矛盾,提高西洋參產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本文就西洋參組織培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域、技術(shù)方法、存在問(wèn)題及解決措施進(jìn)行歸納總結(jié),為西洋參組培技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化提供研究依據(jù)和思路。
西洋參生長(zhǎng)周期較長(zhǎng),種植4~5年后才能結(jié)種,致使種子稀缺且價(jià)格高昂,約 1 000美元/kg[6]。種子需經(jīng)形態(tài)后熟和生理后熟方能發(fā)育完全,休眠期達(dá)200天左右,極大限制了栽培用實(shí)生苗的供應(yīng)量,繼而限制西洋參的種植規(guī)模和市場(chǎng)供應(yīng)。采用組織培養(yǎng)進(jìn)行離體快繁,能夠避開(kāi)西洋參植株結(jié)種和種子休眠期的限制,能在短期內(nèi)提供大量栽培用實(shí)生苗,滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)的需求,同時(shí)縮短西洋參的種植周期,加快市場(chǎng)供應(yīng)。目前組織快繁西洋參雖已開(kāi)展較多研究,但多限于愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng),有關(guān)西洋參分化培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件還需進(jìn)一步優(yōu)化,至今仍未建立穩(wěn)定可行的完整技術(shù)體系,急需對(duì)此加強(qiáng)研究。
自20世紀(jì)80年代至今,我國(guó)引種西洋參已有40余年。迫于栽培初期種苗缺乏、有苗就栽的窘境及參類(lèi)植物種間雜交具有親和性,西洋參種質(zhì)混雜現(xiàn)象日益嚴(yán)重,至今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)西洋參栽培優(yōu)良品種,現(xiàn)有西洋參普遍存在種質(zhì)退化、抗性和產(chǎn)量下降問(wèn)題,嚴(yán)重影響西洋參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,急需選育抗病性強(qiáng)、產(chǎn)量高、生長(zhǎng)健壯的優(yōu)良品系[7]。育種工作的基礎(chǔ)是種質(zhì)資源,西洋參種質(zhì)收集保存的數(shù)量和質(zhì)量直接決定了育種的成功與否。為此應(yīng)構(gòu)建西洋參核心種質(zhì),整合多學(xué)科、多技術(shù)開(kāi)展多元化優(yōu)良品種選育。西洋參組培技術(shù)能夠有效保存植物種質(zhì),借助基因工程等生物學(xué)技術(shù)改良品質(zhì)并繁育優(yōu)良品種[8,9],從而提高西洋參的品質(zhì)和產(chǎn)量,推動(dòng)西洋參產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量、快速發(fā)展,滿(mǎn)足人們的健康需求。
次生代謝產(chǎn)物多數(shù)是藥用植物的有效成分,具有重要的藥理作用和生理活性[10],如西洋參中含有人參皂苷Rb1、Re、Rg1等多種皂苷類(lèi)成分及多糖、氨基酸等,是其改善心血管[11,12]、抗Ⅱ型糖尿?。?3]、抗癌[14]、提高免疫力[15]、抗氧化[16]等多種藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)際上西洋參中這些化學(xué)成分的含量較低,構(gòu)建有效成分的快速合成體系提高產(chǎn)量并開(kāi)展大規(guī)模的提取研究意義重大。采用組培結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得不同基因型的冠癭組織或者毛狀根,并通過(guò)不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件,可加速細(xì)胞繁殖,定向高效誘導(dǎo)西洋參次生代謝產(chǎn)物。此外西洋參冠癭組織或毛狀根培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌污染率較低,更利于大規(guī)模工廠(chǎng)化培養(yǎng)和生產(chǎn)特定成分。研究表明,采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng),較固體培養(yǎng)基培養(yǎng)其生長(zhǎng)速率可提高80%,且無(wú)需加入外源激素,所得次生代謝物含量高、遺傳性狀穩(wěn)定。這也是未來(lái)西洋參有效成分快速獲得的有效途徑。
外植體是決定組培成功與否的首要因素。外植體的選擇因素包括取材部位和取材時(shí)間。盡量選取溫室或人工氣候條件下培養(yǎng)的健壯無(wú)病蟲(chóng)害優(yōu)良植株,其生長(zhǎng)旺盛、狀態(tài)良好的器官、組織和細(xì)胞更是獲得高活力外植體的前提,這對(duì)原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織的形成及植株再生有重要影響。西洋參外植體取材部位較多,花藥、花蕾、葉片、葉柄、子葉、胚軸、根、莖段、根髓、胚等材料均可,其中種胚、子葉、芽苞、葉柄、根的愈傷組織誘導(dǎo)率在69% ~98%,是較好的外植體[17,18]。此外誘導(dǎo)率也受外植體器官本身所處的生理狀態(tài)、發(fā)育時(shí)期及其細(xì)胞所處的分裂期的影響[19]。不同生長(zhǎng)時(shí)期外植體愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著,取材時(shí)間春季為宜,植物體生長(zhǎng)旺盛,細(xì)胞活力強(qiáng),獲得的外植體愈傷組織污染率最低、誘導(dǎo)率最高。劉本葉等[18]研究表明,5月底前后葉片外植體誘導(dǎo)率在95%以上,到6月底取材,誘導(dǎo)率降至30%左右。
公認(rèn)MS培養(yǎng)基最適于西洋參組織培養(yǎng),采用1/2 MS、White培養(yǎng)基的研究偶見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)培養(yǎng)階段、培養(yǎng)目的又將培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基主要以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ),通過(guò)添加不同種類(lèi)、不同比例的生長(zhǎng)激素、礦物質(zhì)、蔗糖等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配制而成。目前西洋參愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)技術(shù)日臻完善和成熟,已為后續(xù)培養(yǎng)工作的順利開(kāi)展奠定扎實(shí)基礎(chǔ)。西洋參愈傷組織誘導(dǎo)研究始于1974年[20],20世紀(jì)90年代起至今相關(guān)研究[21-28]報(bào)道大量出現(xiàn),結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 西洋參組織培養(yǎng)條件和培養(yǎng)結(jié)果
生長(zhǎng)激素、礦物質(zhì)和蔗糖等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物生長(zhǎng)、分化、再生及代謝產(chǎn)物的形成具有特殊的調(diào)節(jié)作用,在整個(gè)組培過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。西洋參組培常用的生長(zhǎng)激素包括2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)[26-28]、吲哚-3-乙酸(IAA)[26]、萘乙酸(NAA)[22,24]、6-芐氨基嘌呤(6-BA)[22,23]、吲哚丁酸(IBA)[21,23]等。其中2,4-D是誘導(dǎo)離體培養(yǎng)西洋參胚狀體發(fā)生的必需因子,直接影響愈傷組織形成及胚狀體發(fā)生。高濃度2,4-D促進(jìn)愈傷組織發(fā)生,誘導(dǎo)率可達(dá)100%,但抑制各種材料的胚狀體發(fā)生,尤其對(duì)培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的無(wú)菌幼苗的抑制效果明顯;相反低濃度的2,4-D均能誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。生長(zhǎng)素IAA、NAA都有助于側(cè)根的發(fā)生及生長(zhǎng),誘導(dǎo)能力IAA >NAA[26]。礦物質(zhì)元素同樣能夠促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。范代娣等[21]測(cè)得,MS培養(yǎng)基添加MgSO4含量為92.5 mg/L時(shí),能有效促進(jìn)嫩莖愈傷組織生長(zhǎng),而MgSO4含量為370 mg/L時(shí),根的愈傷組織生長(zhǎng)速度最快。另外添加蔗糖作為碳源或者合適濃度有機(jī)物也對(duì)西洋參組培有明顯的促進(jìn)作用[17,27]。
西洋參組培過(guò)程中除了受到外植體、培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的成分和配比等因素的影響外,光照、濕度、溫度等多種條件也會(huì)對(duì)西洋參組培產(chǎn)生影響。光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)對(duì)西洋參愈傷組織的誘導(dǎo)沒(méi)有顯著影響;光照培養(yǎng)對(duì)西洋參胚狀體的發(fā)生有一定的促進(jìn)作用。西洋參組培的溫度一般在25℃左右為宜。
西洋參組織培養(yǎng)除了普遍存在遺傳穩(wěn)定性、玻璃化、褐變及污染等常見(jiàn)問(wèn)題外,還面臨一些其它問(wèn)題。
西洋參組織培養(yǎng)大量研究始于20世紀(jì)90年代,已有較長(zhǎng)的研究歷史,但是進(jìn)展相對(duì)緩慢。目前愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)成熟,培養(yǎng)冠癭組織進(jìn)行西洋參次生代謝化合物的合成研究較多,而真正進(jìn)行植物再生和快繁的研究寥寥無(wú)幾,西洋參離體組織培養(yǎng)獲得再生植株的研究未見(jiàn)報(bào)道。分析認(rèn)為西洋參組培過(guò)程中人參皂苷可以通過(guò)細(xì)胞分泌進(jìn)入到周?chē)h(huán)境中,大部分皂苷類(lèi)成分對(duì)組培西洋參的生長(zhǎng)都具有低濃度促進(jìn)和高濃度抑制作用[29]。愈傷組織后期的繼代培養(yǎng)基及組織分化和生根培養(yǎng)基中,皂苷類(lèi)成分日益增多,對(duì)西洋參生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng),造成后續(xù)工作開(kāi)展困難。希望研究者可以突破這個(gè)問(wèn)題,推動(dòng)組培技術(shù)在西洋參快繁、育種中的應(yīng)用,解決西洋參產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的瓶頸問(wèn)題。
鑒于西洋參植物本身的生長(zhǎng)惰性,利用外植體進(jìn)行植株再生過(guò)程中發(fā)根尤其困難。隨著胚狀體誘導(dǎo)再生植株技術(shù)的出現(xiàn),這一問(wèn)題有望解決。研究表明,胚狀體遺傳相對(duì)穩(wěn)定,再生的植株變異較少。更重要的是體細(xì)胞胚具有胚根胚芽?jī)蓸O性,這一特點(diǎn)克服了組培過(guò)程中生根培養(yǎng)困難的問(wèn)題;而且胚狀體存在生理隔離,其胚性細(xì)胞在發(fā)育早期就與其周?chē)钠渌?xì)胞形成明顯界限,隨著發(fā)育的進(jìn)程,最后易與周?chē)M織分離。繞開(kāi)外植體取自西洋參造成的誘導(dǎo)困難、增殖緩慢的瓶頸,另辟蹊徑快速誘導(dǎo)出不定芽,最終成功獲得再生植株。
目前栽培西洋參種質(zhì)混雜,缺少優(yōu)勢(shì)品種,降低了西洋參的產(chǎn)量和質(zhì)量。如何采用組織培養(yǎng)技術(shù)加快育種進(jìn)程、改良品種,對(duì)西洋參產(chǎn)業(yè)發(fā)展和資源保護(hù)意義重大。而體細(xì)胞胚具有單細(xì)胞起源的特點(diǎn),愈傷組織密度高、遺傳穩(wěn)定,是理想的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng),更易開(kāi)展離體篩選、外源基因?qū)牒腕w細(xì)胞雜交等新技術(shù)育種。另外體細(xì)胞胚適合低溫保存,解凍后仍可再生且遺傳性狀穩(wěn)定,為新技術(shù)育種提供了時(shí)間和空間上的便利。
近年來(lái)西洋參組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速,培養(yǎng)條件不斷優(yōu)化,體外次生代謝物生產(chǎn)已取得顯著進(jìn)步。但仍存在一些問(wèn)題需克服,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)西洋參產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。一方面大規(guī)模的西洋參生產(chǎn)仍存在困難,將實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化為大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)是今后努力的方向,繼續(xù)優(yōu)化體外培養(yǎng)方法和技術(shù),特別是克服各種培養(yǎng)基中皂苷類(lèi)成分對(duì)西洋參生長(zhǎng)抑制的瓶頸,促進(jìn)西洋參大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn);另一方面組培過(guò)程中西洋參愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)形成耗時(shí)耗力,且生根困難,需綜合西洋參研究結(jié)果,解析阻礙西洋參組培技術(shù)進(jìn)步的因素,有的放矢、有效縮短培養(yǎng)時(shí)間,推動(dòng)西洋參快繁、育種的進(jìn)步,有效保存、不斷豐富西洋參種質(zhì),促進(jìn)西洋參產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。