孔淑貞, 程璐瑤, 曾小航

(重慶工商大學(xué) a.環(huán)境與資源學(xué)院 b.重慶高校天然藥物研究重點實驗室，重慶 400067)

0 引 言

癲癇(Epilepsy)，又名“羊癇風”，是一種常見的中樞性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其臨床多表現(xiàn)為短暫性意識喪失、肢體痙攣抽搐等行為，具有反復(fù)發(fā)作，久治難愈等特點[1-2]。70%的癲癇患者可以通過藥物治療方式控制，但是還有部分癲癇患者治療效果不佳稱之為難治性癲癇。目前臨床上常用的抗癲癇藥物有托吡酯、拉莫三嗪、左乙拉西坦等，長期服用這些藥物可能會引起一系列中樞神經(jīng)癥狀，如嗜睡、困倦、記憶丟失和注意力不集中等，以及會引起血小板降低、對肝腎功能造成損害等毒副作用[3]。

臨床上近年來越來越多采用中西醫(yī)結(jié)合的方法控制癲癇疾病的發(fā)作。中醫(yī)理論認為癲癇多為風、火、痰、瘀等病因所致，治療時多選用具有清肝瀉火、滌痰開竅、健脾化痰、寧心安神等功用的方藥[4]。采用中藥方劑治療癲癇的歷史悠久，定癇熄風藥、柴貝止癇湯等方劑對癲癇有較好的治療作用，與西藥治療相比不良反應(yīng)較少[5-7]。

《普濟方》卷二百五十七，食治門中記載，榆葉，味甘平滑無毒，主小兒癇，小便不利，傷暑冷服。從典籍中可知，榆葉可能對癲癇疾病具有一定的治療作用。因此采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法建立癲癇動物模型驗證榆葉在癲癇中的治療作用，為榆葉在中藥方劑中的使用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物

健康幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重50～100 g，由騰鑫生物技術(shù)公司提供。隨機分為6組，正常對照組、PTZ癲癇模型組、陽性藥物組、高、中、低榆葉粗提液組每組5只。所有動物均自由飲食，保持恒定室溫在20±2 ℃，12:12 h晝夜循環(huán)光照。

戊四唑(PTZ)，來自于Tocris公司。蘇木素和伊紅來自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。榆葉采自山西省運城市。

1.2 榆葉粗提液制備

稱取干燥的榆葉54 g，加適量自來水在不銹鋼鍋浸泡30 min后放在電磁爐上煎煮3次，合并3次的過濾液，蒸發(fā)濃縮直至濾液體積約為160-170 mL。量取濾液實際體積，計算濾液濃度，取3份分別加蒸餾水稀釋至0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.3 g/mL。

1.3 癲癇模型制備

末次灌胃給藥1 h后按85 mg/kg腹腔注射戊四氮(PTZ)溶液點燃癲癇幼鼠，觀察各組動物行為學(xué)的變化，并依照Racine評分標準對其癲癇發(fā)作程度進行分級評價。Racine評分標準[8]如下:

Ⅰ:咀嚼、眨眼、立須、耳動、流涎、面部抽搐；

Ⅱ:點頭運動、濕狗樣抖動、頸部抽搐；

Ⅲ:單側(cè)肢體抽搐；

Ⅳ:雙側(cè)肢體抽搐的同時伴隨出現(xiàn)站立、全身僵直;

Ⅴ:在Ⅳ的基礎(chǔ)上失去平衡，出現(xiàn)摔倒、身體完全、強直。

1.4 取材及冰凍切片

行為學(xué)實驗結(jié)束后，所有實驗動物使用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，打開胸腔暴露心臟，通過灌注冰生理鹽水進入左心室將動物體內(nèi)血液沖掉，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛進行內(nèi)固定至大鼠四肢、尾巴變硬。之后斷頭取腦組織，從視交叉那里做橫切片取尾端部分。4%多聚甲醛后固定48 h后，梯度蔗糖溶液脫水，先用10%蔗糖PB緩沖液脫水5 h，之后20%蔗糖PB緩沖液脫水5 h，最后移入30%蔗糖PB緩沖液內(nèi)至脫水沉底。將腦組織從蔗糖緩沖液中取出分別放入包埋模具內(nèi)用OCT進行包埋。萊卡冰凍切片機進行切片，片厚10 μm，從海馬結(jié)構(gòu)剛開始出現(xiàn)時開始取片，每5片取1片。

1.5 HE染色

間隔取片進行HE染色，每只動物染色5片。切片置于55 ℃烘箱中1 h，后于室溫復(fù)溫20 min。梯度酒精復(fù)水，無水酒精、95%酒精和70%酒精分別10 min，蒸餾水10 min，0.5% Triton X-100 1 h破膜，TBS緩沖液5 min潤洗3次，蘇木素8 min，1%的鹽酸酒精2 s，自來水20 min返藍，伊紅30 s，烘干后中性塑膠封片。

1.6 顯微鏡觀察與圖像分析

Nikon顯微鏡觀察HE染色切片并進行拍照，對海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目進行計數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤的形式表示，數(shù)據(jù)通過SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，組間差異采用樣本t檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 榆葉粗提液制備

采摘新鮮的榆樹葉，晾干剪碎，稱取一定量的榆葉于不銹鋼鍋中，加適量自來水浸泡30 min后在電磁爐上煎煮，先大火煮沸，再轉(zhuǎn)至小火微沸煎煮，共煎煮3次，每次30 min，中間間隔10 min，每次煎煮完畢后過濾出藥液，再加水煎煮第2次，再次過濾，最終合并3次的濾液即為最終的藥物粗提液。在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，榆葉粗提液在濃縮至大概130～150 mL時開始變成膏狀物，由于膏狀物在稱取、轉(zhuǎn)移等過程中易損耗過多，導(dǎo)致計量濃度不準確，且粗提液在轉(zhuǎn)變?yōu)楦酄钗飼r其成分也可能發(fā)生破壞或轉(zhuǎn)變，因此應(yīng)避免膏狀物的產(chǎn)生，將體積控制在 150 mL 以上。榆葉的用量為54 g，實驗中量取濃縮的粗提液體積為160 mL，則粗提液相當于原料濃度為 0.337 5 g/mL，加蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度使用,見圖1。

圖1 榆葉粗提液的制備Fig. 1 Elm leaf crude extract prearation

2.2 榆葉干預(yù)后對PTZ誘發(fā)大鼠癲癇行為發(fā)作的影響

正常對照組的大鼠，未給予藥物干預(yù)前會出現(xiàn)洗臉、探索等自由探索行為。灌胃給藥生理鹽水后，大鼠行為未出現(xiàn)較大變化，只出現(xiàn)探索行為無明顯異常。PTZ癲癇模型組注射致癇物PTZ后多數(shù)大鼠在1 min左右出現(xiàn)明顯的癇樣行為，開始表現(xiàn)為Racine評分較低的流涎、面部抽搐、眨眼、點頭運動、頸部抽搐等行為，之后發(fā)作行為加劇，會出現(xiàn)單側(cè)肢體抽搐等行為，甚至出現(xiàn)Racine評分Ⅳ、Ⅴ級的雙側(cè)肢體抽搐、全身僵直、跳躍等的癲癇大發(fā)作行為，甚至有少數(shù)大鼠在給藥后由于發(fā)作過于激烈而死亡。0.6 g/kg、1.2 g/kg的榆葉低、中劑量組的大鼠在注射PTZ后癲癇行為發(fā)作與模型組相似，依舊出現(xiàn)比較明顯的癲癇行為。2.4 g/kg榆葉高劑量組的部分大鼠，PTZ誘發(fā)的癲癇行為得到了抑制，僅表現(xiàn)為點頭、頸部抽搐等低級別的行為(圖2)，高劑量榆葉粗提物對PTZ誘發(fā)癲癇行為嚴重程度有一定的抑制作用，可以減輕癲癇發(fā)作的嚴重程度。出現(xiàn)Ⅳ級及以上癲癇行為發(fā)作即為成功的癲癇動物模型。對癲癇行為進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠無明顯癲癇樣行為出現(xiàn)，因此該組癲癇發(fā)生率為0。在腹腔注射PTZ后，PTZ癲癇模型組大量幼鼠出現(xiàn)明顯的癲癇行為發(fā)作，癲癇發(fā)生率達到83%。在給予榆葉粗提物干預(yù)后，癲癇行為得到部分緩解，尤其是榆葉粗提物高濃度組癲癇發(fā)生率為60%，比PTZ癲癇組下降了20%，陽性藥物組癲癇發(fā)生率為80%，因此在高濃度榆葉粗提物的干預(yù)下較好的降低了癲癇的發(fā)生率。

圖2 榆葉粗提物干預(yù)后對PTZ誘發(fā)大鼠癲癇行為發(fā)作率的影響Fig. 2 The effect of elm extract on PTZ induced seizure behavior of rats

2.3 榆葉干預(yù)后對PTZ誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目的影響

如圖3所示，經(jīng)HE染色處理后，在顯微鏡下可以觀察到海馬CA1、CA3區(qū)細胞核被染為藍色，細胞漿被染為紅色，細胞形態(tài)清晰。正常對照組大鼠腦片上的神經(jīng)元細胞較為密集，神經(jīng)元排列整齊有序，神經(jīng)元形態(tài)呈現(xiàn)錐形。PTZ模型組相比對照組細胞分布明顯疏松，部分神經(jīng)元形態(tài)出現(xiàn)異常，說明PTZ誘發(fā)癲癇發(fā)作后可能會引起腦內(nèi)海馬神經(jīng)元的損傷而導(dǎo)致海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少。在給予榆葉粗提物干預(yù)后，榆葉中、高組與PTZ模型組相比，榆葉中、高濃度組其細胞數(shù)目明顯增加，分布相對密集，可能說明榆葉、陽性藥干預(yù)后對PTZ點燃癲癇模型而導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元損傷有一定的保護作用。榆葉中、高濃度組海馬神經(jīng)元的排列及密度與陽性藥組相似。

圖3 榆葉粗提物干預(yù)后對PTZ誘發(fā)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元影響(HE染色)Fig. 3 The effect of elm extract on hippocampus neurons of PTZ induced seizure rats

(a) CA1

(b) CA3

3 討 論

癲癇疾病是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在中醫(yī)學(xué)中稱之為“癇病”。癇病的中醫(yī)治療歷史悠久，《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有關(guān)于癲癇疾病的記載。在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中主要有3種常見的臨床分型:肝風痰濁型、肝腎陰虛型和淤阻腦絡(luò)型。小兒癲癇主要由于脾虛且痰伏，痰濁，因此小兒癲癇患者會出現(xiàn)肝脾功能失調(diào)、氣血瘀滯等癥狀。小兒癲癇的中醫(yī)治療主要針對脾虛、痰濁等表現(xiàn)，臨床上常會采用中醫(yī)中藥療法消痰平風、扶正抗癇、健脾補腎等來進行小兒癲癇的治療以減少癇癥發(fā)作、降低驚厥發(fā)生。在小兒癲癇的治療中，針對不同的癇癥表現(xiàn)及中醫(yī)分型，根據(jù)小兒癲癇疾病的不同發(fā)作時期，辨證論治采用不同的方劑進行治療。近年來有更多的研究從中藥單體中提取活性成分如松果菊苷、天麻素、黃蓮素等，減少大腦內(nèi)炎性因子的表達、抑制小膠質(zhì)細胞增生、活化以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，保護神經(jīng)元減少癲癇的發(fā)作[9-12]。

榆樹，為落葉喬木植物，分布于東北，華北，華東等地區(qū)，長江以南多栽培，其藥用價值非常廣泛，可用于安神、利便，治療水腫、暑熱困悶等癥狀。雖然有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有研究發(fā)現(xiàn)榆葉中含有豐富的葉黃素、微量元素和三萜類化合物等，有益于提高人體的免疫力、抑制脂肪形成等作用[13-15]。，樊金玲[13]在研究榆葉葉黃素的降解動力學(xué)時提到，新鮮的榆樹葉子中葉黃素含量較高，可用作營養(yǎng)強化劑。胡雪原[14]等對榆錢的微量元素進行了測定與價值分析，發(fā)現(xiàn)榆錢含有豐富的Fe、Zn、Cu、Mn等對人體有益的微量元素，其中Fe和Zn的含量最高，F(xiàn)e參與人體內(nèi)血紅蛋白、肌紅蛋白等細胞的合成，缺Zn會導(dǎo)致免疫力低下、食欲不振等，因此，將榆錢用作藥用或食用，對人體都十分有益。此外對榆樹的提取物的相關(guān)研究中，榆樹提取物UD可以直接刺激成骨細胞的細胞增殖分化，說明其對骨細胞中的骨抗再吸收作用是有效的[16]；提取物UP含有至少4種不同的三萜類化合物，可以抑制3T3-L1細胞中脂肪形成，UP提取物可以通過控制細胞周期進程和下調(diào)脂肪形成基因表達來有效減弱脂肪生成[15]。同屬榆屬科的大果榆，多被用于治療泌尿系統(tǒng)疾病，后有研究發(fā)現(xiàn)，其可以有效抑制前列腺細胞的增殖并促進其凋亡，表明其很有希望可以發(fā)展為治療前列腺疾病的有效藥物[17]。

PTZ是一種中樞興奮藥，能夠引起實驗動物迅速出現(xiàn)癲癇行為引起癲癇發(fā)作，是一種常用的經(jīng)典癲癇動物模型。研究通過腹腔注射PTZ建立幼鼠癲癇動物模型，PTZ誘發(fā)的癲癇大鼠發(fā)作時，會出現(xiàn)流涎、頻繁眼睛眨動、前肢后肢抽搐、跳躍或全身強直等行為。在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，PTZ誘發(fā)的癲癇行為發(fā)作屬于肝風痰濁型或淤阻腦絡(luò)型。榆葉粗提物是否能夠?qū)TZ誘發(fā)幼鼠癲癇行為有改善作用呢？研究采用灌胃方式給予PTZ幼鼠癲癇模型榆葉粗提物，通過行為學(xué)觀察和組織學(xué)染色，檢驗給予榆葉粗提物后對PTZ建立的幼鼠癲癇模型大鼠影響。研究首次運用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的方法對天然植物榆葉對癲癇疾病的治療作用進行了驗證。

實驗結(jié)果顯示正常狀態(tài)的大鼠，僅有洗臉、探索等自由活動行為，注射PTZ點燃癲癇模型的大鼠會出現(xiàn)面部抽搐、點頭，甚至四肢抽搐、全身僵直等Racine評分Ⅳ、Ⅴ級的癲癇大發(fā)作行為。組織學(xué)染色顯示，癲癇的發(fā)作會引起海馬CA1、CA3區(qū)的神經(jīng)元細胞數(shù)目減少。PTZ癲癇模型不僅出現(xiàn)了明顯的癲癇行為，HE染色顯示PTZ癲癇模型大鼠的CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目有明顯的減少，這說明在PTZ誘導(dǎo)后，能夠?qū)е麓笫蟀d癇行為的發(fā)作，且對海馬神經(jīng)元細胞有一定損傷，引起神經(jīng)元細胞數(shù)目的減少。當能量耗竭或細胞內(nèi)環(huán)境紊亂后，造成神經(jīng)元受損、細胞凋亡，引起點燃。針對PTZ幼鼠模型這種脾虛、痰濁的表現(xiàn)，研究灌胃給予榆葉粗提物以消痰平風、扶正抗癇。在給予榆葉粗提物干預(yù)后，癲癇動物無論是癲癇行為發(fā)作還是神經(jīng)元損傷方面均有較好的改善。榆葉粗提物不僅降低了癲癇發(fā)作行為的級別，而且高劑量的榆葉粗提物干預(yù)將癲癇模型的發(fā)生率降低了20%，對癲癇行為的發(fā)作有一定的抑制作用。因此，榆葉粗提物對幼鼠癲癇行為的發(fā)作有一定的改善作用

通過HE染色對海馬神經(jīng)元損傷進行檢測發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的榆葉粗提液干預(yù)較為明顯的抑制了癲癇導(dǎo)致的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少，中高劑量的榆葉干預(yù)對癲癇導(dǎo)致的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少也有一定的抑制作用。組織學(xué)染色結(jié)果表明在給予榆葉粗提液干預(yù)后，榆葉粗提液中的有效成分可能對海馬神經(jīng)元有一定的保護作用，減少癲癇發(fā)作對神經(jīng)元損傷引起的凋亡，從而降低了癲癇行為發(fā)作。

癇癥以突然撲倒、昏不識人、口吐涎沫、肢體抽搐等癥狀為特征。雖然古籍有記載榆葉主小兒癇但一直無現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明。PTZ癲癇幼鼠出現(xiàn)流涎、眨眼、頸部肌肉抽搐、肢體抽搐等癥狀，屬于中醫(yī)中脾虛、痰濁的表現(xiàn)。研究通過動物行為學(xué)觀察及組織學(xué)染色等方法揭示了中高濃度的榆葉粗提液對PTZ誘發(fā)的癲癇行為有一定的改善作用，可以抑制癲癇導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元數(shù)目減少，可以通過對海馬神經(jīng)元的保護作用來發(fā)揮對癲癇幼鼠脾虛、痰濁的治療作用。實驗對古籍中記載的榆葉功效通過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的方法進行了驗證，驗證了榆葉粗提液對幼鼠癲癇有一定的治療作用，可以減輕幼鼠癲癇行為的嚴重程度、降低幼鼠癲癇的發(fā)生率，減弱癲癇幼鼠海馬神經(jīng)元免受癲癇樣放電引起的損傷。因此研究發(fā)現(xiàn)中高濃度榆葉粗提液對幼鼠癲癇的治療作用，對進一步開發(fā)新的癲癇治療藥物提供了實驗依據(jù)和新的藥物開發(fā)方向。

4 展 望

癲癇在中醫(yī)學(xué)中稱之為“癇病”，在很多醫(yī)書中都有關(guān)于癇病發(fā)作及治療的記載，最早可以追溯到戰(zhàn)國秦漢階段，《五十二病方》和《黃帝內(nèi)經(jīng)》均有癇病治療方劑、方法的記錄。最近二十年來，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進行癲癇的治療案例越來越多。關(guān)于中醫(yī)認為癇病發(fā)作多由痰、風、淤所致。針對不同的致病原因、癥狀表現(xiàn)及癲癇發(fā)病的階段，采用辨證論治采用不同的方劑進行治療，在發(fā)作期以疏肝理氣、祛痰開竅為主，緩解期當扶正祛邪進行治療。治療癲癇常用的方劑有定風湯、止癇湯、息風膠囊等[18-21]，可以減少癲癇棘波的發(fā)放，減輕癲癇行為的癥狀及發(fā)生頻率，降低持續(xù)時間，有效率可以達到50%～98%。近年來更多的研究發(fā)現(xiàn)中藥中的有效活性成分在治療癲癇疾病中發(fā)揮了非常重要的作用，可以改善神經(jīng)遞質(zhì)失衡，修復(fù)受損的離子通道和神經(jīng)元，減輕膠質(zhì)細胞激活、增生，減輕炎癥反應(yīng)，并具有較好的抗氧化活性。除此之外，胡椒中提取的胡椒堿[22]、東亞鉗蝎中提取的蝎毒素BmK IM[23]、黑種草里提取到的百里香醌[24]可以降低炎癥因子的表達、減少興奮性遞質(zhì)的釋放、抗氧化等作用，從而改善癲癇行為發(fā)作、發(fā)揮對癲癇的治療作用。近年來越來越多的研究傾向于在傳統(tǒng)中藥中提取有效的活性成分用于癲癇疾病的治療研究，開發(fā)新的癲癇疾病的治療藥物。

榆葉其藥用價值非常廣泛，可用于安神、利便，治療水腫、暑熱困悶等癥狀。古籍記載榆葉主小兒癇，因此研究通過行為學(xué)觀察和組織學(xué)實驗對榆葉在癲癇治療中的作用進行了研究。但是研究僅對榆葉中治療幼鼠癲癇模型的作用進行了初探，雖然顯示出了一定的抑制癲癇行為和改善神經(jīng)元的作用，但是具體是哪些有效成分起作用仍不清楚。榆葉中含有豐富的葉黃素、微量元素和三萜類化合物等，雖然有研究發(fā)現(xiàn)這些活性成分有提高免疫力、治療泌尿系統(tǒng)疾病的作用，但不清楚究竟是否葉黃素或三萜類化合物也發(fā)揮了抗癲癇的作用。而且癲癇發(fā)作的機制非常復(fù)雜[25]，可能是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)占優(yōu)勢引起，也有可能是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)受損造成的。在癲癇發(fā)生后，繼而會引起小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活、增生等炎癥反應(yīng)。榆葉粗提物在發(fā)揮對癲癇行為的改善作用時是否通過干預(yù)了神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的平衡或者減輕了膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)也不清楚。在未來的研究中，一方面可以對榆葉天然活性成分進行提取分離，并進行每種活性成分的藥效學(xué)作用研究，以尋找新的治療小兒癲癇的有效活性成分。另外，也需要對榆葉提取物的作用機制進行進一步的研究和探索，才能更好地發(fā)揮榆葉粗提物在癲癇疾病中的應(yīng)用。