謝春燕， 熊曉莉

(1.重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067；2.重慶博樂農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，重慶 402493)

0 引 言

蚯蚓(Earthworm)是一種雜食性環(huán)節(jié)動物，其蛋白質(zhì)含量豐富，是重要的動物蛋白來源。新鮮蚯蚓體內(nèi)蛋白可達10%，干蚯蚓中蛋白質(zhì)平均含量為60%[1]。蚯蚓也是一種多功能性生物資源[2]，可用于提取蚓激酶、多肽等活性物質(zhì)，提取后的剩余殘體仍含有大量蛋白質(zhì)，通過酶解制備酶解液，可作為復(fù)合蚯蚓營養(yǎng)液、飼料添加劑等產(chǎn)品的原料來源，提高蚯蚓的經(jīng)濟附加值[3-4]。

目前，已有關(guān)于利用外源蛋白酶水解蚯蚓的研究，覃麟等[5]研究了堿性蛋白酶酶解蚯蚓的酶解參數(shù)，并對酶解工藝進行了優(yōu)化；劉波等[6]利用枯草蛋白酶酶解蚯蚓，水解液中氨基氮數(shù)可達 16.55 mmol/100 mL；王彬彬等[6]研究了3種單一外源酶對蚯蚓水解效率的影響。以上研究都僅限于采用單一外源蛋白酶對蚯蚓進行水解。因蛋白酶的酶切位點具有專一性，一種蛋白酶只能切斷特定類型的幾種肽鍵，故單獨一種蛋白酶很難實現(xiàn)對蚯蚓蛋白的深度水解。采用外源性復(fù)合蛋白酶對蚯蚓蛋白進行水解，可提高水解度，降低蚯蚓酶解液的分子量，提高酶解液中氨基酸含量。呂迎蘭等[7]研究了由彈性蛋白酶和胰蛋白酶組成的復(fù)合酶對蚯蚓粉進行水解，水解度與單一酶相比有大幅提升。

試驗對7種外源蛋白酶酶解能力進行系統(tǒng)比較，并采用均勻設(shè)計法對復(fù)合酶的最適比例進行優(yōu)化，建立回歸方程模型并對其進行分析得到最佳配比，在提高蚯蚓蛋白水解度的同時也為優(yōu)化蚯蚓蛋白水解工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平二號蚯蚓，購于重慶鑫香焰鼎農(nóng)業(yè)公司。外源蛋白酶(7種)購于江蘇銳陽生物科技公司，其性能參數(shù)見表1。其他試劑均為市售分析純。

表1 7種蛋白酶最優(yōu)參數(shù)范圍Table 1 Optimum parameter ranges of seven kinds of proteases

1.2 儀器與設(shè)備

組織搗碎機(FK-A，江蘇金城國勝)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(WZY-110X30，上海智城)；離心機(TDZ5-WS，長沙湘儀)；石墨消解儀(SH420F，濟南海能)；凱氏定氮儀(K110F，濟南海能)。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解液制備工藝流程

工藝參考文獻[2]，并做適當改進。蚯蚓吐泥處理(24 h)→洗凈并濾干水分→組織搗碎→酶解→滅酶(100 ℃，15 min)→離心(3 700 r/min，15 min)→酶解液(上清液)→測定指標。

1.3.2 不同蛋白酶對蚯蚓蛋白的酶解能力

按料液比(蚯蚓漿∶水)1∶1，取7份鮮蚯蚓漿，以加酶量1%(酶用量/蚯蚓質(zhì)量)分別加入7種外源蛋白酶，進行單一外源蛋白酶酶解試驗，同時以不加酶作為空白對照。根據(jù)1.3.1工藝流程，在自然pH、恒溫振蕩器120 r/min、酶解溫度50 ℃下酶解10 h，反應(yīng)結(jié)束后測定酶解液水解度，每種酶進行10次平行測定，將其與空白組進行方差分析。

1.3.3 測定方法

氨基氮測定采用甲醛滴定法，總蛋白氮含量測定采用凱氏定氮法[8]。

水解度%(DH)=(上清液中氨基氮含量/原料中總蛋白氮含量)×100%。

1.3.4 復(fù)合酶組成選擇

在單一外源酶試驗的基礎(chǔ)上，以蛋白酶最適pH和溫度為主要參考因素，結(jié)合水解效率、價格以及最終復(fù)合酶所需的參數(shù)一致性原則等因素考慮，選擇木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶和菠蘿蛋白酶進行復(fù)合配比優(yōu)化。

1.3.5 復(fù)合酶組成的優(yōu)化

根據(jù)1.3.4復(fù)合酶組成，確定其存在兩個自由變量，即設(shè)x1、x2分別為木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶的含量，則菠蘿酶在整個復(fù)合酶中的含量為 1-x1-x2。兩個自變量x1和x2可自由變化的范圍均為0～100%。

對自變量x1和x2進行均勻設(shè)計試驗，采用均勻設(shè)計表U30(3013)，選擇第1、10列，對x1、x2配比含量進行計算，并根據(jù)計算結(jié)果進行酶解試驗，測定水解度，采用SPSS 19.0進行回歸分析，采用Miscrosoft Visual FoxPro 9.0對回歸方程進行計算得出最優(yōu)配方組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對蚯蚓蛋白的酶解能力比較

由圖1可知，外源酶的添加對蚯蚓蛋白水解度的影響效果是顯著的(P<0.05)。其中，酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解能力較強，胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶水解能力較弱。

圖1 不同蛋白酶酶解蚯蚓蛋白水解度Fig. 1 The degree of hydrolysis of earthworm protein by different proteases

在自然pH條件下，蚯蚓液的pH在5.5～6.7之間，由表1可知，在弱酸性條件下胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶的酶解能力被削弱，而酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶則可充分發(fā)揮酶解能力，達到較好的酶解效果。此外，木瓜蛋白酶能作為一種半光酰胺基蛋白酶，對動物肉質(zhì)中的結(jié)締組織蛋白和膠原纖維具備較好的水解性能，水解活性極高[9]。

2.2 復(fù)合酶組成的優(yōu)化

均勻設(shè)計試驗方案及結(jié)果如表2所示，采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多項回歸擬合，獲得水解度Y對自變量x1、x2和x3的回歸方程為Y=58.975+8.270x2+12.256x1x2x3+7.677x1x3-5.243x22，相關(guān)系數(shù)R2=0.939，調(diào)整后的R2=0.929。

表2 復(fù)合酶均勻設(shè)計優(yōu)化實驗結(jié)果 %

由表2可知：復(fù)合酶水解度均高于單一酶水解度，這是因為，在這3種酶中，木瓜酶和菠蘿酶屬于內(nèi)切蛋白酶，作用點常位于肽鏈內(nèi)部，可迅速降低蛋白質(zhì)的分子量，酸性酶屬于外切蛋白酶，作用位點常位于肽鏈兩端，可獲得較多的游離氨基酸[10]。利用內(nèi)切蛋白酶與外切蛋白酶的特異性催化位點不同的特點，采用三酶協(xié)同水解，可有效增加蛋白酶的特異性催化位點[9]，使得復(fù)合酶對蚯蚓蛋白進行充分水解，降低蚯蚓蛋白分子量，提高蛋白質(zhì)水解度。

表3 回歸模型回歸分析結(jié)果Table 3 Regression analysis results of the regression model

2.3 水解效果比較

表4列出了不同酶水解蚯蚓蛋白的能力。由表4對比可以看出，單一外源蛋白酶在一定程度上對蚯蚓蛋白具有水解作用，但水解效果不佳，水解度基本未超過50%，而采用復(fù)合酶進行水解則可大大提高水解度，使蚯蚓蛋白水解較完全，達到較優(yōu)的水解效果。

表4 不同酶水解蚯蚓蛋白的能力比較Table 4 Comparison of the ability of different enzymes to hydrolyze earthworm protein

3 結(jié) 論