姚景麗，武靜橋，范真瑋，李丹，藍肇煜，王小月，趙微，陳婷，何敬文，金天明

(天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院/天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)引起的豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocide，Pm)引起的豬萎縮性鼻炎(porcine infectious atrophic rhinitic，AR)以及豬肺疫(swine pneumonic pasteurellosis)是豬場常見的呼吸道傳染病，常呈混合感染。2種細菌性疾病均通過外源感染，通常經(jīng)分泌物、排泄物，也可通過被病原菌污染的車輛、器具以及飼養(yǎng)人員的衣物等間接接觸傳播，小嚙齒類動物和鳥也可能傳播本病[1-2]。因此，有效的疫苗接種是防控豬肺疫與傳染性胸膜肺炎的主要手段，二聯(lián)疫苗的研發(fā)具有現(xiàn)實必要性。

菌影是一種不含核酸、核糖體等內(nèi)部其他組分的細菌空殼，通過噬菌體phiX174裂解基因E的表達使細菌的細胞內(nèi)膜和外膜發(fā)生融合，形成直徑為40～400 nm的特異性跨膜孔道結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)內(nèi)容物在滲透壓的作用下由此孔道排出而形成[3]。E基因表達的過程保留了細菌的表面抗原成分和結(jié)構(gòu)，能夠?qū)τ袡C體產(chǎn)生體液免疫、細胞免疫以及局部的黏膜免疫應(yīng)答[4]。同時細菌菌影具有裝載單一抗原或不同抗原復(fù)合物、毒力不反強的特點，可利用菌影作為新型疫苗和遞送載體[5]。

巴氏桿菌OmpH作為菌體外膜蛋白的一種，可有效誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異抗體，從而發(fā)揮免疫保護作用。本課題組在前期試驗中，將巴氏桿菌外膜蛋白OmpH質(zhì)粒導(dǎo)入APP菌影，以APP菌影為載體制備二聯(lián)亞單位疫苗。在菌影介導(dǎo)下，OmpH在抗原提呈細胞中表達并提呈，進一步增強了OmpH抗原誘發(fā)免疫反應(yīng)的能力。此二聯(lián)疫苗在小鼠試驗中，免疫后誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體滴度均高于單一疫苗，二聯(lián)疫苗對小鼠的APP I型活菌攻毒的保護效率為100%，對Pm D型活菌的攻毒保護效率為90%[6]。為了進一步驗證二聯(lián)疫苗免疫保護效果，本課題組在天津市某規(guī)模豬場選取30頭4周齡仔豬進行疫苗免疫效果評估試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌影與質(zhì)粒來源

APP菌影、OmpH質(zhì)粒由本實驗室制備。

1.1.2 試驗動物

天津市某規(guī)模豬場4周齡仔豬30頭。

1.1.3 試劑

EILSA試劑盒，購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；FITC標記大鼠CD3+、APC標記大鼠CD4+、PE標記大鼠CD8+抗體、紅細胞裂解液，購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 APP裝載OmpH質(zhì)粒油乳疫苗制備

將APP菌影、OmpH質(zhì)粒、APP菌影裝載OmpH質(zhì)粒3種疫苗原液進行凍干，分別將3種凍干質(zhì)粒用純化水復(fù)溶，使APP菌影溶液濃度為1.4×109CFU/mL、OmpH質(zhì)粒溶液濃度為625 μg/μL，等比例將上述2種質(zhì)粒混合，制備APP菌影裝載OmpH質(zhì)粒二聯(lián)苗，開啟高剪切機對以上3種疫苗進行分散乳化5 min。

1.2.2 試驗分組

將30頭4周齡(w)仔豬隨機分為APP組(接種APP疫苗)、OmpH組(接種OmpH疫苗)、APP+OmpH組(接種APP+OmpH二聯(lián)苗)和安全試驗組，其中前3組每組7頭，安全試驗組9頭。

1.2.3 安全性試驗

將制備的3種疫苗分別接種安全試驗組仔豬，每種疫苗接種3頭，4 mL/頭，肌肉注射，2 d內(nèi)觀察有無異常變化。

1.2.4 免疫及采血時間

首免前，APP組、OmpH組、APP+OmpH組分別隨機選取4頭仔豬采血(分別采取抗凝血與非抗凝血)，作為試驗對照組；采血后同日對3組試驗組仔豬分別肌肉注射疫苗(2 mL/頭)進行首免；首免2周后(6 w)進行采血(同上)，采血后同日進行二免(方法同首免)，二免3周后(9 w)采血。

1.2.5 流式細胞術(shù)試驗

1.2.5.1 淋巴細胞提取與染色

將新鮮全血加入3倍體積的紅細胞裂解液混勻，冰上靜置15 min，待紅細胞充分裂解后，收集白細胞，反復(fù)加入裂解液混勻重懸，提取淋巴細胞。依照流式抗體染色說明書進行，將所用抗體對細胞進行染色。

1.2.5.2 流式細胞儀檢測與數(shù)據(jù)分析

根據(jù)流式抗體染色配色特點，進行儀器調(diào)試。使用FlowJo軟件進行分析，首先圈出淋巴細胞，CD3+細胞以其占所圈淋巴細胞的百分比計算[7]，CD4+、CD8+細胞分別以其占CD3+細胞的百分比計算[8]。

1.2.6 ELISA檢測

采血后，常溫靜置30 min，3 000 r/min，離心5 min，取淡黃色血清，并標記。依照ELISA試劑盒操作說明書，進行樣品稀釋、加樣、孵育、洗滌、加酶標二抗、洗滌、再孵育、加顯色劑、加終止液及酶標儀讀數(shù)等步驟進行試驗。

1.2.7 血液常規(guī)、血液生試驗

取抗凝，用血液分析儀、生化分析儀進行分析。

1.2.8 統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行t檢驗、方差分析。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細胞術(shù)分析免疫細胞水平

2.1.1 疫苗免疫后CD3+細胞占淋巴細胞百分比變化情況

由圖1可見，3種疫苗免疫后外周血中CD3+細胞均呈上升趨勢，二免后(9 w)APP+OmpH二聯(lián)苗組所產(chǎn)生的CD3+細胞比例極顯著高于免前對照組(4 w)(P<0.01)，且極顯著高于APP組與OmpH組(P<0.01)。同時，APP與OmpH組的CD3+細胞比例上升差異顯著(P<0.05)，APP組CD3+細胞比例高于OmpH組。

2.1.2 疫苗免疫后CD4+細胞、CD8+細胞占淋巴細胞百分比變化情況

由圖1、圖2、圖3所示，3種疫苗首免后(6 w)，CD4+細胞占淋巴細胞比例均呈上升趨勢，APP+OmpH二聯(lián)苗組CD4+細胞上升比例極顯著高于APP與OmpH組(P<0.01)，APP組CD4+細胞上升比例高于OmpH組(P<0.05)；二免后(9 w)3種疫苗免疫后CD4+細胞均呈下降趨勢，APP與OmpH組下降比例高于APP+OmpH二聯(lián)苗組；二免后CD8+細胞較一免出現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)，且APP+OmpH二聯(lián)苗組CD8+細胞升高比例極顯著高于APP與OmpH組(P<0.01)，APP組CD8+細胞升高比例高于OmpH組(P<0.05)。

2.1.3 疫苗免疫后CD4+細胞、CD8+細胞占CD3+細胞百分比變化情況

由圖1、圖4可見，3種疫苗經(jīng)首免和二免后，CD8+細胞占CD3+細胞比例整體呈上升趨勢，且二免后極顯著升高(P<0.01)，與CD8+細胞占總淋巴細胞比例情況相符；CD4+細胞占CD3+細胞比例情況，3種疫苗首免后整體體呈上升趨勢，二免后整體下降，與CD4+細胞占總淋巴細胞比例情況相符。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同

圖2 CD4+細胞占淋巴細胞比例

圖3 CD8+細胞占淋巴細胞比例

Q1. CD8+細胞；Q2. CD8+、CD4+細胞；Q3. CD4+細胞；Q4. CD8+、CD4+細胞

2.2 ELISA檢測抗體水平

2.2.1 APP疫苗和APP+OmpH二聯(lián)疫苗免疫后對仔豬APP抗體的影響

APP抗體量增長情況如圖5所示，首免后(6 w)APP組與APP+ OmpH聯(lián)苗組較免前(4 w)組仔豬抗體量出現(xiàn)極顯著增高(P<0.01)，且APP+ OmpH聯(lián)苗組抗體量增長極顯著高于APP(P<0.01)；二免后(9 w)，APP組抗體量較首免上升極顯著(P<0.01)，APP+ OmpH聯(lián)苗組顯著高于APP組抗體量(P<0.05)，APP+ OmpH聯(lián)苗組抗體增長率為60.31%。

2.2.2 OmpH疫苗和APP+OmpH二聯(lián)苗免疫后對仔豬OmpH抗體的影響

OmpH抗體量增長情況如圖6所示，首免后(6 w)，OmpH組抗體量較免前(4 w)未出現(xiàn)顯著高(P>0.05)，APP+OmpH聯(lián)苗組抗體量出現(xiàn)顯著增高(P<0.05)，兩者組間比較，抗體增加量差異極顯著(P<0.01)；二免后(9 w)，OmpH組、APP+OmpH聯(lián)苗組抗體均顯著增高(P<0.05)，二免后APP+OmpH聯(lián)苗組抗體量仍顯著高于單苗(P<0.05)，抗體增長率為13.42%。

圖5 APP抗體變化

2.3 血常規(guī)試驗

2.3.1 3種疫苗免疫后對仔豬白細胞的影響

由表1可見，3種疫苗在首免、二免后，白細胞數(shù)顯著高于免前(4 w)(P<0.05)；首免后(6 w)，3種疫苗組間白細胞數(shù)變化不明顯(P>0.05)；二免后(9 w)，APP+OmpH聯(lián)苗組白細胞數(shù)量較APP單苗組、OmpH單苗組顯著增高(P<0.05)，2種單苗組間白細增加數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

圖6 OmpH抗體變化

表1 疫苗免疫后對白細胞的影響 ×109個/L

2.3.2 3種疫苗免疫后對仔豬淋巴細胞的影響

由表2可見，3種疫苗二免后，淋巴細胞較首免(6 w)顯著增高(P<0.05)，首免(6 w)較免前(4 w)無顯著變化(P>0.05)。3種疫苗組間淋巴細胞數(shù)變化不顯著(P>0.05)，但淋巴細胞數(shù)量整體呈上升趨勢。二免后，APP+OmpH聯(lián)苗組淋巴細胞數(shù)增加較多，但無顯著差異(P>0.05)。

表2 疫苗免疫后對淋巴細胞的影響 ×109個/L

2.3.3 3種疫苗免疫后對仔豬中性粒細胞的影響

由表3可見3種疫苗免疫后中性粒細胞數(shù)整體呈增加趨勢，3種疫苗首免后(6 w)中性粒細胞極顯著增高(P<0.05)，二免后(6w)無顯著增高(P>0.05)，其中APP+OmpH聯(lián)苗組中性粒細胞數(shù)在首免、二免后較APP、OmpH組均增加較多，但組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 疫苗免疫后對中性粒細胞的影響 ×109個/L

2.3.4 3種疫苗免疫后對仔豬中性粒細胞的影響

由表4可見，4種疫苗免疫后單核細胞整體呈增長趨勢，且首免(6 w)、二免(9 w)后，均出現(xiàn)顯著增多(P<0.05)。首免后，組間中性粒細胞數(shù)無明差異(P>0.05)。二免后，APP+OmpH聯(lián)苗組中性粒細胞數(shù)較2個單苗組顯著增加(P<0.05)。

表4 疫苗免疫后對單核細胞的影響 ×109個/L

2.3.5 APP、OmpH、APP+OmpH疫苗免疫后對仔豬紅細胞的影響

由表5可見，3種疫苗首免(6 w)及二免(9 w)后，對紅細胞數(shù)量影響差異不顯著(P>0.05)。

表5 疫苗免疫后對紅細胞的影響 ×1012個/L

2.4 血生化檢測

3種疫苗免疫后，檢測血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)含量。由圖7可見，每種疫苗免疫后總蛋白含量整體增高；二免后(9 w)，APP單苗組、APP+OmpH聯(lián)苗組較OmpH單苗組增高，差異極顯著(P<0.01)，APP+OmpH聯(lián)組較APP單苗增高顯著(P<0.05)；白蛋白各組間無明顯變化(P>0.05)；球蛋白呈上升趨勢，二免后，2個單苗組間無顯著差異(P>0.05)，APP+OmpH聯(lián)組與2個單苗組比較，增長極顯著(P<0.01)。

圖7 血清中TP、LB、GLB含量比較

3 討論

胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌是豬場常見的呼吸道系統(tǒng)傳染病的致病菌，這兩種細菌在致病性上具有相似性，常呈混合感染，特別是慢性胸膜肺炎病例往往多繼發(fā)A型多殺性巴氏桿菌感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。目前，生產(chǎn)實踐中多采用疫苗控制上述疾病，常用的豬傳染性胸膜肺炎疫苗有滅活苗、弱毒苗和亞單位疫苗，豬肺疫疫苗有滅活苗及弱毒苗。上述疫苗均存在優(yōu)缺點，其中滅活苗的成本低，安全、方便，但交叉保護能力差；弱毒苗交叉保護及免疫效果好，但有毒力返強的危險；亞單位疫苗安全，制備方便，需與適當佐劑配合，才能發(fā)揮最佳效果，其交叉保護能力不如弱毒苗，且滅活過程造成抗原表位缺失或抗原性減弱，導(dǎo)致免疫效果不確定且副作用較大等缺點。

研究表明，APP滅活苗可有效防止豬產(chǎn)生臨床癥狀，但無法抵御菌體于呼吸道系統(tǒng)的定殖，即仍可在免疫豬呼吸系統(tǒng)中分離出該病原菌，且特定血清型替換滅活苗無法保護豬不被異種血清型菌株感染。而APP菌影疫苗不僅可防止豬產(chǎn)生臨床癥狀，還可抵御菌體定殖，且Western blot試驗表明其具有交叉保護的潛力。巴氏桿菌OmpH抗原作為菌體外膜蛋白的一種，可有效誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生特異性抗體反應(yīng)，從而發(fā)揮保護作用。將OmpH質(zhì)粒載入菌影，在菌影介導(dǎo)下，OmpH抗原在APC中表達并提呈，菌影進一步增強了OmpH抗原誘發(fā)免疫反應(yīng)的能力，而且為機體提供了危險警示信號，起到了天然佐劑的作用。二者相輔相成，在發(fā)揮各自免疫作用的同時，又為免疫效應(yīng)的強化發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。

本試驗前期通過引入金黃色葡萄球菌核酸酶A，使其與噬菌體PhiX 174裂解蛋白E串聯(lián)表達，構(gòu)建雙基因裂解系統(tǒng)，極大地提高了APP菌影的裂解效率。同時將多殺性巴氏桿菌保護性抗原OmpH質(zhì)粒導(dǎo)入APP菌影，以其為載體，發(fā)揮靶向作用，通過小鼠試驗證明APP菌影裝載OmpH質(zhì)粒二聯(lián)疫苗對APP和Pm感染均具有保護作用，保護率可達100%[9-11]。

體液免疫和細胞免疫在機體抗感染過程中起著重要的作用?？贵w是一種由漿細胞分泌的蛋白質(zhì)，在機體內(nèi)有中和毒素、阻斷病原體入侵、清除病原微生物等多種作用[12]。細胞免疫主要通過T淋巴細胞介導(dǎo)，不同表型T淋巴細胞數(shù)量的改變對于監(jiān)測免疫效果具有指導(dǎo)意義[13]。CD3+、CD4+和CD8+是T淋巴細胞的3個主要亞群，所以本研究主要評估以上3種免疫細胞的變化情況。結(jié)果表明，CD3+、CD4+和CD8+細胞比例呈較明顯上升趨勢，與經(jīng)典弱毒苗、滅活苗免疫后，結(jié)果一致[14]。值得一提的是血清中抗體結(jié)果顯示，二聯(lián)疫苗二免后抗體上升顯著，單苗APP試驗組較OmpH試驗組抗體上升顯著，可能與二聯(lián)苗制備過程中裝載的OmpH質(zhì)粒濃度有關(guān)，有待進一步驗證。本研究的實施，擴大了動物疫苗的研究方法，彌補了現(xiàn)有疫苗的部分缺點，豐富了疫苗品種，提高了豬傳染性胸膜肺炎和豬巴氏桿菌病疫苗的保護效率，對該病的防控具有一定的應(yīng)用價值。