王莉，聞雙全，賀雙江，曹瑩，鄒輝，顧建紅，劉學(xué)忠，卞建春，劉宗平，袁燕*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

鎘是一種存在于環(huán)境中的重金屬，與許多重金屬不同，鎘具有良好的水溶性，可經(jīng)水體在土壤中富集并被植物吸收，通過食物鏈進(jìn)入人和動物體內(nèi)[1]。由于鎘在體內(nèi)能長期蓄積，不易排除，故易產(chǎn)生慢性和長期的病理效應(yīng)，可損傷許多組織和系統(tǒng)，其中包括肝臟、腎臟、骨骼、睪丸、腦等[2-4]。慢性鎘中毒可導(dǎo)致神經(jīng)癥狀，如頭痛、眩暈、嗅覺功能障礙等，引起帕金森病、阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病[2,5]。此外，鎘也是一種脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)劑，能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過量的超氧化自由基，從而引起過氧化損傷。因此，其毒性與生物氧化損傷密切相關(guān)[6]。誘導(dǎo)自由基過量產(chǎn)生、導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激是鎘主要毒性機(jī)制之一[3,7]。Almeer等[8]研究表明，小鼠經(jīng)腹腔注射氯化鎘6.5 mg/kg，連續(xù)處理7 d，導(dǎo)致鎘在大腦皮質(zhì)中累積，且與氧化和抗氧化失衡密切相關(guān)。為探究慢性鎘暴露對小鼠大腦皮質(zhì)的毒性損傷作用，本試驗(yàn)選取雌性BALB/c小鼠，用不同濃度氯化鎘自由飲水染毒16個(gè)月的方式建立慢性鎘中毒模型，測定腦系數(shù)、病理組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，從體內(nèi)探討慢性鎘暴露對小鼠大腦皮質(zhì)的毒性損傷作用，為闡明鎘神經(jīng)毒性損傷機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性BALB/c小鼠，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。

1.2 主要試劑

總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA 蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司) ；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(新賽美生物科技有限公司)；無水氯化鎘(Sigma，USA)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物分組與處理

36只5周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，于室溫(22±1) ℃，濕度控制在50%～60%的環(huán)境下預(yù)飼1周后隨機(jī)分為3組分籠飼養(yǎng)，飲水中添加氯化鎘的濃度分別為0(對照組)、5 和25 mg/L，持續(xù)飲用以上3種濃度的鎘水16個(gè)月。試驗(yàn)結(jié)束后，禁食禁水12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，剝離完整腦組織，分離大腦皮質(zhì)備用。

1.4 腦系數(shù)測定

稱量完整腦組織，計(jì)算腦系數(shù)，即腦系數(shù)(%)=腦重(g)/體重(g)×100 %。

1.5 大腦皮質(zhì)病理組織學(xué)觀察

取出腦組織，4%多聚甲醛固定，70%、80%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制作石蠟切片。乙醇洗去二甲苯，流水沖洗，蘇木精染色，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)，水洗至不變色，伊紅復(fù)染，流水沖洗，自然干燥，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.6 大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的觀察

冰上取1 mm×1 mm×1 mm大腦皮質(zhì)組織塊于2.5%戊二醛中，4 ℃固定，0.1 mol/L PBS清洗3次后1%鋨酸固定，0.1 mol/L PBS清洗3次后分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，100%丙酮于室溫下浸透12 min，樹脂包埋組織塊，60 ℃烘箱內(nèi)放置48 h后切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。

1.7 大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

比色法檢測大腦皮質(zhì)中T-SOD、CAT、GSH-PX活性和GSH、MDA含量，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 22. 0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)和單因素方差(ANOVA)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性鎘暴露對小鼠腦系數(shù)的影響

動物處死后，立即摘取各組小鼠完整腦組織，肉眼未見明顯病理變化。稱重、計(jì)算腦系數(shù)，結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，5和25 mg/L氯化鎘組小鼠腦系數(shù)均顯著下降(P<0.05)。

與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 慢性鎘暴露對小鼠大腦皮質(zhì)病理組織學(xué)的影響

如圖2所示，對照組小鼠大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，排列整齊密集，胞核大而圓，少見深染的神經(jīng)元；鎘組小鼠大腦皮層組織均可見不規(guī)則空洞(白色箭頭)，大量神經(jīng)元細(xì)胞核深染、固縮，呈三角形或不規(guī)則形(黑色箭頭)，部分核仁不明顯，胞核與胞質(zhì)界限模糊，并伴有小膠質(zhì)細(xì)胞增生(灰色箭頭)，且25 mg/L鎘組還可見大量的神經(jīng)元排列紊亂。

2.3 慢性鎘暴露對小鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖3所示，對照組細(xì)胞核完整，染色質(zhì)較均勻，線粒體嵴有少量斷裂但結(jié)構(gòu)較為完整；5 mg/L鎘組細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的不規(guī)則形態(tài)，線粒體嵴斷裂，基質(zhì)中有片狀空腔；25 mg/L鎘組細(xì)胞核皺縮嚴(yán)重，核內(nèi)染色質(zhì)向細(xì)胞核膜邊緣聚集(邊聚)，線粒體損傷較嚴(yán)重，大部分線粒體嵴斷裂、溶解，基質(zhì)中有片狀空腔，呈空泡變性，線粒體膜部分破損。

A.對照組；B.5 mg/L鎘組；C.25 mg/L鎘組

白色箭頭指示損傷線粒體

2.4 慢性鎘暴露對小鼠大腦皮質(zhì)中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖4所示，與對照組相比，5 mg/L和25 mg/L鎘組小鼠大腦皮質(zhì)中T-SOD活力均極顯著下降(P<0.01)，CAT活力顯著下降(P<0.05)，MDA、GSH含量極顯著升高(P<0.01)；5 mg/L氯化鎘組GSH-PX活力顯著升高(P<0.05)，25 mg/L氯化鎘組GSH-PX活力極顯著升高(P<0.01)。

圖4 小鼠大腦皮質(zhì)中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

3 討論

鎘是真核細(xì)胞中有毒且非必需的二價(jià)金屬離子。慢性低濃度鎘暴露主要是吸入含鎘的煙霧和受污染的飲食引起，導(dǎo)致鎘在神經(jīng)系統(tǒng)積聚，嚴(yán)重影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[9-10]。臟器系數(shù)是毒理試驗(yàn)中常用指標(biāo)，能直接反映靶器官的生長發(fā)育情況，也能間接地反映病理組織的變化。臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變等。龍夢菲[11]研究表明，SD大鼠連續(xù)1周每日采用腹腔注射的方式給予醋酸鎘(按體重2.5 mg/kg)，可導(dǎo)致大鼠腎臟系數(shù)顯著增大，造成腎臟充血、水腫或增生。趙世文[12]研究表明，SD大鼠經(jīng)自由飲水染毒(50 mg/L醋酸鎘溶液)，連續(xù)處理12周，大鼠腦指數(shù)顯著下降。本研究結(jié)果顯示，鎘暴露16個(gè)月導(dǎo)致小鼠腦系數(shù)顯著降低，說明長期鎘暴露對小鼠腦生長發(fā)育產(chǎn)生一定的影響。

病理組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化可直接反映致病因素對組織損傷的程度。在體內(nèi)試驗(yàn)研究中，因所用動物的年齡和種屬差異，鎘導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性損傷的報(bào)道有所不同。動物試驗(yàn)表明，小鼠皮下注射氯化鎘，每周2次，每次2 mg/kg，可引起小鼠中腦黑質(zhì)受損，神經(jīng)元變性、壞死，黑質(zhì)區(qū)有嚴(yán)重的軟化灶形成，精神行為改變等[13]。Almeer等[8]研究表明，小鼠經(jīng)腹腔注射6.5 mg/kg氯化鎘，連續(xù)處理7 d，可引起小鼠皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為出現(xiàn)核染色深的退化神經(jīng)元，炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)空泡。Unsal等[14]研究表明，大鼠皮下注射氯化鎘1 mg/kg，連續(xù)處理30 d，導(dǎo)致大鼠額葉皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)異常改變，包括神經(jīng)元胞質(zhì)萎縮、核固縮以及空泡化，形成組織水腫。本研究發(fā)現(xiàn)，雌性BALB/c小鼠經(jīng)不同濃度氯化鎘(0、5和25 mg/L)自由飲水染毒16個(gè)月，可引起小鼠大腦皮質(zhì)病理學(xué)改變，表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞核深染、固縮，呈三角形或不規(guī)則形，胞核與胞質(zhì)界限模糊，并伴有小膠質(zhì)細(xì)胞增生。重金屬暴露可直接干擾線粒體內(nèi)的巰氫基和巰基集團(tuán)，釋放大量的活性氧，當(dāng)活性氧的水平達(dá)到一定高度，便會引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致線粒體功能損傷[15]。Yang等[16]研究表明，幼年小鼠經(jīng)不同濃度氯化鎘(1.87、3.74和7.48 mg/kg)自由飲水染毒，連續(xù)10 d，中、高劑量染鎘組均可引起幼鼠大腦皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷，高劑量鎘組超微結(jié)構(gòu)損傷更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為大腦皮層神經(jīng)元異染色質(zhì)邊緣化，核膜不完整，核周間隙增寬，線粒體嵴模糊。Chen等[17]研究表明，小鼠經(jīng)飲水暴露于不同濃度鎘(0、10和50 mg/L)6周，可致小鼠大腦皮層神經(jīng)元出現(xiàn)明顯空泡化、不規(guī)則腫脹，線粒體嵴斷裂。本研究表明，雌性BALB/c小鼠經(jīng)不同濃度氯化鎘(0、5和25 mg/L)自由飲水染毒16個(gè)月，可導(dǎo)致小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞核及線粒體損傷，表現(xiàn)為核皺縮，染色質(zhì)邊聚，線粒體嵴斷裂、溶解，部分呈空泡變性。說明長期的鎘暴露可致小鼠大腦皮質(zhì)病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)損傷。

氧化應(yīng)激是鎘致機(jī)體毒性作用的重要機(jī)制之一。氧化應(yīng)激是由于正常的氧化與抗氧化平衡狀態(tài)被破壞而引起的。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，機(jī)體能夠應(yīng)付輕微的氧化應(yīng)激，而嚴(yán)重的氧化應(yīng)激超過細(xì)胞的抗氧化能力，會對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA造成損害，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[18]。此外，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，測定MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度[19]。

SOD-CAT系統(tǒng)被認(rèn)為是對抗活性氧類毒性的第一道防線，SOD可催化超氧陰離子自由基為H2O2，H2O2被CAT進(jìn)一步分解為H2O和O2，從而減輕H2O2對組織的損傷[20]。曲莉等[19]研究表明，小鼠經(jīng)腹腔注射氯化鎘2.0 mg/kg，每周2次，連續(xù)4周，可引起小鼠腦組織SOD活性降低，MDA含量明顯升高，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷。大鼠口服氯化鎘5 mg/kg體重，處理6 d，可致大鼠腦組織中SOD與CAT活性降低，MDA含量增加[21]。SOD、CAT活性降低與MDA含量增加是氧化損傷的表現(xiàn)。本研究表明，鎘暴露16個(gè)月能夠引起小鼠大腦皮質(zhì)中SOD、CAT活性降低以及MDA含量增加，說明慢性鎘暴露可破壞腦組織的氧化平衡，引起腦組織氧化損傷。

GSH系統(tǒng)也是一種重要的抗活性氧的抗氧化防御系統(tǒng)[18]。GSH-PX是一種重要的過氧化物降解酶，將GSH氧化為谷胱甘肽二硫化物(GSSG)的過程中，促進(jìn)過氧化氫的分解，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能免受過氧化物的干擾和損傷。然后GSSG被谷胱甘肽還原酶(GR)還原為GSH，從而形成氧化還原循環(huán)以防止氧化損傷[22]。同時(shí)，GSH-PX以GSH為底物，將脂質(zhì)過氧化物還原為無毒的脂質(zhì)醇。這種相互轉(zhuǎn)化的循環(huán)使細(xì)胞中的自由基得以持續(xù)清除[23]。趙世文[12]研究表明SD大鼠經(jīng)自由飲水染毒(50 mg/L醋酸鎘溶液)，連續(xù)處理12周，導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)GSH-PX活性和GSH含量升高。此外，Hatcher等[24]研究表明，GSH水平升高是細(xì)胞對鎘的適應(yīng)性反應(yīng)，鎘可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH合成。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露16個(gè)月可引起小鼠大腦皮質(zhì)中GSH含量和GSH-PX活性升高，與前人研究結(jié)果一致，這是GSH系統(tǒng)被激活的表現(xiàn)。而在慢性鎘暴露16個(gè)月引起細(xì)胞氧化損傷的情況下，GSH含量和GSH-PX活性仍然升高，這可能與GSH與GSH-PX的相互轉(zhuǎn)化循環(huán)有關(guān)。

總之，慢性鎘暴露可引起小鼠大腦皮質(zhì)損傷，這可能與鎘降低SOD-CAT抗氧化系統(tǒng)酶活性而引起的氧化應(yīng)激有關(guān)。此外，GSH抗氧化防御系統(tǒng)在腦組織抵抗慢性鎘毒性損傷中發(fā)揮重要作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。