潘 迪 馬挺軍

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

黃榆(Ulmusmacrocarpa)為榆科榆屬落葉喬木或灌木植物，高達20 m，胸徑30 cm，分布于我國東北及華北、西北部分省區(qū)，朝鮮、俄羅斯也有分布[1]。作為防護林工程的優(yōu)良樹種之一，黃榆可防風固沙、固土保水、城市綠化，不僅生態(tài)價值巨大，還具有較高的藥用價值。研究表明黃榆提取物具有抗腫瘤、抗過敏[2]、抗氧化、抗皮膚衰老[3]、抗高脂血[4]、免疫[5]等藥理功效。本實驗室測得黃榆籽中，脂肪含量9.44 g/100 g，蛋白質(zhì)23.5 g/100 g，總糖(以葡萄糖計)4 g/100 g，灰分3.65 g/100 g，水分及揮發(fā)物5.044 g/100 g。因此，黃榆籽油具有廣闊的開發(fā)前景。

植物油的提取方法有壓榨法[6]，浸提法[7]，超聲波輔助法[8]，水酶法[9]等，雖然都取得了一定效果，但壓榨法出油率低、浸提法和超聲輔助法存在溶劑殘留、水酶法酶的選擇性高等缺點。而超臨界二氧化碳萃取法可以克服上述提取方法的不足，它是在超臨界狀態(tài)下使用二氧化碳作為溶劑，可以在較低的溫度下進行萃取，不會對熱敏性物質(zhì)產(chǎn)生影響，更不會引起部分物質(zhì)的氧化，具有綠色、無毒、無溶劑殘留、萃取率高、操作簡便等優(yōu)點，但該方法儀器設(shè)備昂貴，且相關(guān)理論及技術(shù)要求較高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，目前也僅用作小油種提取油脂的中試和小批量生產(chǎn)[10-12]。高妮娜等[13]比較了壓榨法、溶劑浸提法、水酶法和超臨界CO2萃取法對奇亞籽油品質(zhì)特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超臨界CO2萃取法的油脂得率最高(85.5%)，其次是溶劑浸提法(65.8%)和壓榨法(40.9%)，水酶法最低(33.2%)。阿吉姑·阿布都熱西提等[14]采用正交實驗優(yōu)化了萃取壓力、溫度、CO2流量和萃取時間對巴旦杏仁油超臨界CO2萃取得率的影響，結(jié)果表明萃取壓力35 MPa、萃取溫度40 ℃、二氧化碳流量6 L/min、萃取時間4 h 為最優(yōu)條件，在此條件下巴旦杏仁油萃取得率達到43.10%。Achicanoy等[15]采用超臨界二氧化碳萃取番茄籽油，得到的最佳萃取條件為壓力38.1 MPa，溫度64 ℃，萃取率為21.07%。故本實驗采用超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油。

劇烈運動會增加能量消耗，加速活性氧的積累，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生身體疲勞[16]。而補充具有抗氧化能力的物質(zhì)，可以提高抗氧化酶活性，從而延長運動能力，減少身體疲勞[17]。有文獻報道，油脂中的亞油酸、亞麻酸和油酸等不飽和脂肪酸，具有抗氧化、降血脂、增強免疫力等功效[18]。此外，植物油脂中的活性成分如植物甾醇、生育酚、黃酮類、多酚類等，也具有抗氧化、抗衰老活性[19]。黃榆籽油作為新型的植物油脂，也受到了關(guān)注，但目前國內(nèi)對黃榆籽油體內(nèi)抗疲勞、抗氧化作用的研究鮮見報道。本實驗以黃榆籽為原料，采用超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油，在單因素的基礎(chǔ)上采用正交試驗，研究萃取壓力、萃取溫度、萃取時間對黃榆籽油萃取率的影響；然后對在此條件下萃取的黃榆籽油進行理化性質(zhì)分析；并將其灌喂小鼠，通過小鼠負重游泳實驗，分析小鼠體內(nèi)抗疲勞、抗氧化活性，以期為黃榆籽油的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃榆籽采自吉林省國家級向海自然保護區(qū)蒙古黃榆樹林(內(nèi)蒙古科爾沁保護區(qū)黃榆林5，6月(該樹一般兩年結(jié)一次果，果熟5-6月)；CO2純度99.99%，食用級；色拉油 Aceties Monterreal S.A；香菇多糖片；鼠維持顆粒飼料 生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0012；尿素氮測定試劑盒(BUN)、乳酸試劑盒(LA)、肝糖試劑盒(LG)、丙二醛試劑盒(MDA)、超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH-Px)；氫氧化鈉、甲醇、三氟化硼均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PE AutoSystem XL-TurbeMass GC/MS聯(lián)用儀，毛細管色譜柱為SE254型(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，超臨界流體萃取系統(tǒng)，UV-1601PC型可見紫外分光光度計，雷杜Chemray360全自動生化分析儀，HD型單列恒溫水浴鍋，小鼠籠具規(guī)格300 mm×180 mm×130 mm，材質(zhì)為PC聚碳酸酯。

1.3 動物

雄性ICR小鼠 60只，起始體重(17.9±1.0)g，6周齡，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0009。

實驗小鼠被圈養(yǎng)在籠子里，每籠6只。在恒溫(20～25 ℃)和濕度50%～70%下，每日12 h/12 h光/暗交替照明(早上8點到晚上8點光照)，并且小鼠在SPF(特異性無病原體)動物飼養(yǎng)室內(nèi)可自由食用標準飼料和無菌飲用水。

1.4 實驗方法

1.4.1 黃榆籽油的超臨界流體萃取

參考王玉玲等[20]的方法，取清理去雜后的黃榆籽，在干燥箱中于105 ℃烘烤2 h后粉碎，過60目篩子，備用。準確稱取一定量的黃榆籽粉投入萃取釜中，調(diào)節(jié)系統(tǒng)的溫度、壓力至設(shè)定值，CO2流量為2.5 L/min，然后進行循環(huán)萃取。當達到設(shè)定時間后，從出料口收集產(chǎn)物并計算萃取率，每組實驗重復(fù)3次，取平均。按下式計算黃榆籽油的萃取率。

萃取率=(萃取的黃榆籽油質(zhì)量/黃榆籽粉質(zhì)量)×100%

1.4.2 單因素實驗

按照1.4.1的實驗方法，以黃榆籽油萃取率為試驗指標，分別考察萃取壓力(10、20、30、40、50、60 MPa)、萃取溫度(10、20、30、40、50、60 ℃)、萃取時間(30、60、90、120、150 min)對黃榆籽油萃取率的影響，采用控制變量法，確定各個因素的大致范圍。

1.4.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、萃取時間(C)為考察因素，每個因素選取3個水平，萃取率為考察指標，采用L9(34)正交表進行試驗。具體因素水平值見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.4.4 黃榆籽油的理化性質(zhì)分析

酸價按GB 5009.229—2016測定，過氧化值按GB 5009.227—2016測定，碘值按GB/T 5532—2008測定，皂化值按GB/T 5534—2008 測定，水分及揮發(fā)值含量按GB 5009.236—2016測定。

1.4.5 抗疲勞、抗氧化實驗

1.4.5.1 動物分組及飼喂

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)體重將小鼠隨機分為5組，每組12只：正常對照組(NC)、陽性對照組(PC)、低劑量組(LD)、中劑量組(MD)和高劑量(HD)。樣品低、中、高劑量組每只小鼠每天分別灌胃黃榆籽油2.5、5、10 mL/kg(以體質(zhì)量bw計，下同)；正常對照組小鼠每只每天灌喂等量色拉油10 mL/kg；陽性對照組小鼠每只每天灌喂香菇多糖300 mg/kg。每日1次，連續(xù)28 d，灌胃期間自由取食和飲水。

不同劑量黃榆籽油的配制方法：高劑量直接應(yīng)用黃榆籽油原油，中、低劑量組用色拉油稀釋配制，用時攪拌器混勻。密封，4 ℃冰箱貯藏，備用；使用時充分搖勻，每次給藥剩余藥液廢棄。

1.4.5.2 小鼠力竭游泳實驗

參考馬挺軍等[21]的方法，小鼠負重游泳實驗如下：末次給藥1 h后，在小鼠尾部負小鼠體重5%的鉛皮，投入水溫為(27±0.5) ℃，水深40 cm的游泳箱中游泳，從放入小鼠開始計時，至小鼠沉于水面下10 s后不能浮出水面的時間作為力竭游泳時間，觀察并記錄小鼠的力竭游泳時間。

1.4.5.3 抗疲勞生化指標測定

參考Xia等[22]方法并進行修改，小鼠負重游泳1 h后，眼球采血，血凝固后2 000 r/min離心15 min，取血清凍存，用于測定血尿素氮(BUN)、血乳酸(LA)。之后立即處死小鼠，取其肝臟，經(jīng)冰凍生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，用于測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和肝糖原(LG)含量。其中，BUN用全自動生化分析儀測定，其他指標均按照試劑盒進行操作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 萃取壓力對黃榆籽油萃取率的影響

從圖1可以看出，萃取壓力在10～30 MPa范圍內(nèi)，隨著萃取壓力的增加，黃榆籽油的萃取率逐漸增大，達到30 MPa時萃取率達到最大值40.89%。這是因為萃取壓力升高，CO2密度增大，從而對溶質(zhì)溶解性能增加，有利于萃取[23]。當萃取壓力超過30 MPa時，黃榆籽油的萃取率沒有明顯變化。在實際生產(chǎn)過程中，萃取壓力過大會導(dǎo)致企業(yè)的經(jīng)營成本和設(shè)備投資明顯增加。綜合考慮，選擇萃取壓力為30 MPa。

圖1 萃取壓力、萃取溫度、萃取時間對黃榆籽油萃取率的影響

2.1.2 萃取溫度對黃榆籽油萃取率的影響

由圖1可知，隨著萃取溫度的升高，黃榆籽油的萃取率先增大后減小。當萃取溫度為40 ℃時，萃取率達到最大值。這可能是因為萃取溫度的升高，蒸汽壓增大，使分子間熱運動加劇，提高了黃榆籽油在CO2中的溶解度進而萃取速率提高；但是溫度升高還會導(dǎo)致CO2流體的密度降低，從而降低了黃榆籽油溶解度[24]。因此，確定了最佳萃取溫度為40 ℃。

2.1.3 萃取時間對黃榆籽油萃取率的影響

如圖1所示，隨著萃取時間延長，黃榆籽油萃取率逐漸增大。這是因為萃取剛開始時，超臨界二氧化碳流體與黃榆籽接觸的較少，萃取率低，隨著時間延長，兩者充分接觸導(dǎo)致萃取率增大。當萃取時間超過120 min后，黃榆籽油的萃取率趨于平緩。這是由于黃榆籽油大部分被萃取出來，萃取時間繼續(xù)延長會導(dǎo)致能耗增大。所以選擇萃取時間為120 min。

2.2 正交實驗

從表2可以看出，各因素對黃榆籽油萃取率的影響順序為：萃取壓力>萃取時間>萃取溫度(A>C>B)。根據(jù)表3的方差分析結(jié)果，萃取壓力(A)對超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油的萃取率有顯著影響，萃取溫度(B)和萃取時間(C)對黃榆籽油萃取率影響不顯著。綜合分析正交實驗結(jié)果，確定最佳工藝條件為A2B3C2，即萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為50 ℃，萃取時間為120 min，通過實驗驗證，該條件下的萃取率為45.26%。

表2 L9(34) 正交實驗結(jié)果

表3 方差分析表

2.3 黃榆籽油的理化性質(zhì)

GB 2716—2018規(guī)定：食用植物油的酸價(KOH)≤3 mg/g，過氧化值≤0.25 g/100 g。由表4可知，超臨界二氧化碳萃取的黃榆籽油的酸價為3 mg/g，過氧化值0.052 g/100 g，符合食用植物油標準。

表4 黃榆籽油品質(zhì)分析

2.4 黃榆籽油抗疲勞、抗氧化實驗

2.4.1 黃榆籽油對小鼠力竭游泳時間的影響

力竭游泳時間是小鼠運動能力的體現(xiàn)，也是抗疲勞試驗指標之一。近年來，藥用植物多糖被認為是一種新型的天然抗疲勞劑，故選擇香菇多糖作為陽性對照組。由圖2可知，與NC組相比，各組小鼠力竭游泳時間均延長。LD、MD組均延長不顯著；HD、PC組均延長極顯著(P<0.01)，分別延長了4.67倍、20.37倍。以上結(jié)果表明，香菇多糖和黃榆籽油均可延長小鼠的力竭游泳時間，在不同劑量組黃榆籽油中高劑量組效果最好。

注：NC-空白，PC-香菇多糖組。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。圖2 黃榆籽油對小鼠力竭游泳時間的影響

2.4.2 黃榆籽油對小鼠BUN、LA、LG含量的影響

血尿素氮BUN是蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物，當身體不能從碳水化合物和脂肪中獲得能量時，蛋白質(zhì)和氨基酸就成為分解代謝的替代來源，以滿足能量需求，因此BUN含量升高導(dǎo)致機體產(chǎn)生疲勞[25]。此外，長時間的運動還會增加肌肉的耗氧量，進而導(dǎo)致缺氧，加速糖酵解，產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，如乳酸和丙酮；而乳酸的積累會使肌肉和血液的pH降低，直接或間接導(dǎo)致肌肉運動能力下降，造成運動性疲勞[26，27]。由圖3可知，與NC組相比，各組的BUN、LA含量均有所降低，HD組小鼠的BUN、LA含量顯著降低(P<0.05)，分別降低了17.11%、24.37%；PC組小鼠的LA含量顯著下降了27.97%(P<0.05)，而其他各組小鼠的BUN、LA含量無顯著性差異。結(jié)果說明，黃榆籽油在高劑量下能有效抑制血尿素氮和乳酸的產(chǎn)生，延緩疲勞的發(fā)生，與香菇多糖效果相一致。

圖3 黃榆籽油對小鼠BUN、LA、LG含量的影響

肝糖原是運動過程中重要的能量來源，它可以被分解轉(zhuǎn)化成葡萄糖，為機體運動提供更多的能量，從而延緩運動疲勞的產(chǎn)生[28]。由圖3可見，與NC組相比，各劑量組小鼠的LG含量均有所升高，其中，PC組小鼠的LG含量極顯著升高(P<0.01)，而黃榆籽油劑量組中隨著劑量的增加，小鼠的LG含量逐漸升高，在HD組時達到顯著水平(P<0.05)，并且比PC組提高了24.04%。這說明黃榆籽油可提高小鼠體內(nèi)肝糖原的含量，且高劑量組黃榆籽油的作用效果優(yōu)于香菇多糖。

2.4.3 黃榆籽油對小鼠MDA、SOD、GSH-Px含量的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，MDA含量降低，可以減輕氧化應(yīng)激，改善運動性疲勞[29]。SOD和GSH-Px是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除積累的氧自由基，維持體內(nèi)平衡，減弱活性氧的作用，從而保護細胞結(jié)構(gòu)不受破壞，防止疲勞的發(fā)生[30]。由表5知，與NC組相比，各劑量組MDA含量均有所降低，PC組顯著降低(P<0.05)，LD、MD組降低不顯著，HD組極顯著降低(P<0.01)；與NC組相比，各劑量組SOD和GSH-Px活力均有所升高，其中，SOD活力在HD組升高極顯著(P<0.01)，而在其余各組均無顯著性差異；GSH-Px活力在MD、HD組均顯著提高(P<0.05)，在PC組極顯著提高(P<0.01)。這表明，黃榆籽油可以提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性，防止過度運動引起的氧化應(yīng)激，降低氧化損傷。隨著黃榆籽油劑量的增加，其作用效果越顯著，甚至優(yōu)于香菇多糖。

表5 黃榆籽油對小鼠MDA、SOD、GSH-Px含量的影響

3 結(jié)論

通過單因素和正交實驗設(shè)計，超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油的最佳工藝為萃取壓力30 MPa、萃取溫度50 ℃、萃取時間120 min，在此條件下黃榆籽油油萃取率為45.26%。

對萃取的黃榆籽油進行理化實驗分析，酸價為3 mgKOH/g、過氧化值為0.052 g/100 g、碘值為7.8 gI/100 g、皂化值為300 mg/g、水分及揮發(fā)物含量為3.51 g/100 g。本試驗測得的油脂的各項指標均在食用油標準范圍之內(nèi)，所以黃榆籽可以作為開發(fā)食用油的新食品原料。

與對照組相比，黃榆籽油高劑量組可顯著延長小鼠游泳時間(P<0.05)，降低BUN、LA含量(P<0.05)，并提高LG含量(P<0.05)；同時，顯著提高SOD、GSH-Px活力(P<0.05或P<0.01)，降低MDA水平(P<0.01)。表明黃榆籽油具有良好的抗疲勞、抗氧化活性，且其活性與黃榆籽油劑量呈正相關(guān)，達到高劑量組時活性最強。