梁 悅，穆海龍，賀濤濤，張凱睿，李園園，范云鵬，麻武仁，劉迎秋，宋曉平

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

螨病(Acariasis)是由疥螨科和癢螨科的螨類寄生于動物體表或表皮內(nèi)引起的外寄生蟲病，以接觸感染、皮膚劇癢和炎癥為特征，普遍存在于世界各地，可見于各年齡段的多種動物，易造成患病動物生產(chǎn)性能下降，消化吸收機能降低，消瘦，甚至造成動物個體或大批死亡，同時也威脅人類健康[1-3]。兔癢螨(Psoroptescuniculi)主要侵害兔耳部，引起外耳道炎，滲出物干燥結(jié)痂堵塞耳道，病兔耳朵下垂，搖頭搔癢，嚴重時蔓延至篩骨或腦部，引起癲癇[4-5]。目前，我國家兔飼養(yǎng)量已達7億只，占世界飼養(yǎng)量的40%，兔癢螨病在我國23個省中流行，病死率高達70%，給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大損失[6]。研究表明，丁香及其提取物具有顯著殺螨活性，并進行了微乳劑研制[1,7]。本試驗依據(jù)寵物用抗體外寄生蟲藥物藥效評價試驗指導原則[8]，進行丁香提取物微乳對自然感染兔癢螨病的實驗性臨床試驗，旨在為進一步研發(fā)應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 自然感染癢螨病兔50只(其中伊高樂兔16只，加利福尼亞兔16只，伊拉兔8只，獺兔6只，青紫藍兔4只)，健康兔10只(其中伊高樂兔5只、加利福尼亞兔2只、伊拉兔3只)，3月齡～8月齡，體重1.6 kg～3.6 kg，均購自陜西省武功縣和周至縣等養(yǎng)殖場。

1.1.2 試驗藥物 丁香提取物微乳(丁香提取物1%，聚氧乙烯氫化蓖麻油26.3%，丙二醇8.8%，油酸乙酯3.9%，水60%，其中丁香酚含量0.05%)，西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院中獸醫(yī)實驗室自制；伊維菌素溶液(含量0.3%，批號20180601)，北流市銅州藥業(yè)有限公司。

1.1.3 主要試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(批號181201)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(批號181201)、總蛋白試劑盒(批號181201)、白蛋白試劑盒(批號181201)、肌酸激酶試劑盒(批號181201)、尿素氮試劑盒(批號190101)、肌酐試劑盒(批號181201)，湖南永和陽光生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 PH50系列生物顯微鏡，鳳凰光學科技有限公司產(chǎn)品；PL2002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；隔水式培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；TEK-II mini全自動三分群血液分析儀，江西特康科技有限公司產(chǎn)品；日立7180型全自動生化分析儀，日本株式會社日立高新技術(shù)產(chǎn)品；EDTA-K2抗凝管(批號20180701)，江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；真空采血管(批號20180301)，湖南平安醫(yī)械有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病例選擇

1.2.1.1 診斷標準 外耳道有炎癥滲出物，干固形成黃色痂皮，嵌在耳道內(nèi)，甚至堵塞耳道如紙卷樣，病兔耳朵下垂，不時搖頭，抓撓耳朵，刮取痂皮顯微鏡下觀察有兔癢螨(P.cuniculi)存在[9]。

1.2.1.2 納入標準 符合臨床相關(guān)診斷標準。

1.2.1.3 排除標準 患有其他皮膚病和已用藥物治療。

1.2.2 分組及處理 符合納入標準的癢螨病兔50只，依照就診順序編號，利用隨機數(shù)表法分為5組，每組10只。其中丁香提取物微乳高、中、低劑量組，涂擦給藥，分別每天4、2、1次，連用3 d；藥物對照組，涂擦伊維菌素溶液，每天2次，連用3 d；疾病對照組，不用任何藥物；另選健康兔10只作為健康對照組，試驗周期為14 d。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 感染程度及評分 試驗第0天、第7天和第14天時，檢查耳部炎癥滲出物及結(jié)痂情況，鏡檢有無螨蟲，并對感染程度進行評分：無滲出物或螨蟲0分；耳道滲出物但未見螨蟲0.5分；耳道有少量痂皮有螨蟲1分；外耳道充滿痂皮有螨蟲2分；耳道和耳廓近端1/4有痂皮有螨蟲3分；耳廓1/2充滿痂皮有螨蟲4分；耳廓3/4充滿痂皮有螨蟲5分；整個耳廓內(nèi)充滿痂皮有螨蟲6分[10]。計算不同試驗組的平均分值，并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.3.2 蟲體減少率和蟲體轉(zhuǎn)陰率檢查 試驗第0天、第7天和第14天時，采集患部結(jié)痂，置于干凈平皿中用攝子搗碎混勻，挑取約0.1 g置35℃培養(yǎng)箱中0.5 h～1 h，收集螨蟲并計數(shù)，按以下公式分別計算每只試驗兔的蟲體減少率和不同試驗組的蟲體轉(zhuǎn)陰率[11-12]。

1.2.3.3 血常規(guī)指標檢測 試驗第0天和第4天，耳緣靜脈采血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管，進行血液學指標檢測，主要包括白細胞(WBC)、淋巴細胞(Lym)、中間細胞(Mid)、粒細胞(Gra)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)和血小板(PLT)等。

1.2.3.4 血液生化指標檢測 試驗第0天和第4天，耳緣靜脈采血4 mL，置于非抗凝管，室溫靜置0.5 h～2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，進行血液生化指標檢測，主要包括谷氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酸激酶(CK)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)等。

1.2.3.5 病理剖檢 試驗結(jié)束時對各組兔進行剖檢，肉眼觀察病變，取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、子宮、睪丸等，剔除多余組織稱重，計算臟器系數(shù)。

1.2.4 療效判定標準 試驗第14天時，檢查每只兔耳部螨蟲數(shù)量，計算蟲體減少率，并結(jié)合臨床癥狀綜合判定療效。有效：耳部螨蟲數(shù)量平均減少率≥90%，患部無瘙癢，無滲出物，無痂皮或有少量痂皮；無效：耳部螨蟲數(shù)量平均減少率<90%，患部仍有瘙癢、有滲出物、有痂皮[8]。

有效率=(各組有效試驗動物數(shù)/各組試驗動物數(shù))×100%

無效率=(各組無效試驗動物數(shù)/各組試驗動物數(shù))×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標準差表示，計數(shù)數(shù)據(jù)用百分比(%)表示，應用SPSS19.0進行單因素或卡方檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 治療效果

使用丁香提取物微乳不同劑量治療后，病兔耳部癥狀均有所改善，結(jié)痂脫落(圖1)，螨蟲數(shù)量明顯減少。在治療后7 d時，高、中劑量組的感染程度及評分均極顯著降低，與低劑量組比較差異極顯著(P<0.01)，與藥物對照組相當(P>0.05)；高、中劑量組的蟲體減少率與低劑量組比較差異極顯著(P<0.01)。試驗14 d時，不同劑量組的蟲體轉(zhuǎn)陰率達70%～100%，高、中劑量組的蟲體減少率與低劑量組、藥物對照組比較差異極顯著(P<0.01)，且高、中劑量組間效果相當(P>0.05)(表1～表3)。說明丁香提取物微乳噴涂給藥，每天4次，或2次，連用3 d，對兔癢螨病具有顯著治療效果。

2.2 丁香提取物微乳對血常規(guī)的影響

結(jié)果見表4。由表4可知，試驗第4天，丁香提取微乳不同劑量組的WBC、Lym、Gra、RBC、HGB、PLT等血液學指標，與藥物對照組和疾病對照組均差異不顯著(P>0.05)，說明丁香提取物微乳對血液學指標無明顯異常影響。

2.3 丁香提取物微乳對血液生化指標的影響

試驗第4天時，丁香提取物微乳不同劑量組的ALT、AST、TP、ALB、CK、CRE等血液學指標，與疾病對照組比較差異不顯著(P>0.05)；與健康對照組比較，ALT、TP、CK、BUN、CRE差異不顯著(P>0.05)，ALB極顯著低于健康對照組(P<0.01)，且高劑量組的AST極顯著低于健康對照組(P<0.01)，BUN變化無規(guī)律(表5)。說明丁香提取物微乳對兔血液生化指標無明顯異常影響。

A～C.分別為丁香提取物微乳高、中、低劑量組；D.藥物對照組；1～3.分別為第0、7、14天時的耳部癥狀

表1 兔癢螨感染程度及評分

表2 丁香提取物微乳對蟲體減少率和轉(zhuǎn)陰率的影響

表3 丁香提取物微乳對兔癢螨的臨床治療效果Table 3 Effects of Eugenie caryophyllata extract microemulsion on the treatment of Psoroptes cuniculi infection in rabbits

表4 丁香提取物微乳對試驗兔血常規(guī)的影響

2.4 丁香提取物微乳對兔臟器的影響

丁香提取物不同劑量組家兔解剖未見明顯異常變化，心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等臟器系數(shù)與疾病對照組比較差異不顯著(P>0.05)；不同劑量組的心臟系數(shù)、高劑量組的胃系數(shù)極顯著高于健康對照組(P<0.01)(表6)。說明丁香提取物微乳對兔臟器形態(tài)無明顯異常影響。

表5 丁香提取物微乳對試驗兔血液生化指標的影響

表6 丁香提取物微乳對兔臟器系數(shù)的影響

3 討論

丁香為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb)的干燥花蕾，性味辛溫，主要含有揮發(fā)油，丁香酚為其主要成分，具有顯著殺螨活性[1]，丁香酚可通過影響螨蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、單胺氧化酶(MAO)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、Ca2+-ATP酶活性，引起細胞功能紊亂，促進螨蟲死亡[13]；丁香酚還可通過調(diào)控兒茶酚酸(Ca)、硫氧還蛋白(Trx)的mRNA表達，抑制螨蟲細胞色素P450活性，對兔癢螨產(chǎn)生殺滅作用[14-15]。郭超[7]對丁香提取物及其微乳劑的制備工藝進行了優(yōu)化試驗，并證明丁香提取物微乳對離體兔癢螨具有顯著殺滅作用，且該微乳劑室溫避光保存時穩(wěn)定[16]。本試驗結(jié)果表明，丁香提取物微乳涂擦給藥，每天2次或4次，連用3 d，第7天時病兔耳道結(jié)痂脫落，癥狀明顯減輕，第14天時蟲體轉(zhuǎn)陰率達100%，有效率達100%；血液學指標、血液生化指標及組織器官無明顯異常變化，說明使用安全，臨床推薦用法用量為涂擦給藥，每天2次，連用3 d。