王 豪，郭苗苗，劉昕雨，左 瑤，李 寧，孫 薇，張 濤，王 令

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

抗生素具有廣泛和高效的抑菌或殺菌作用，被大量用于臨床和畜牧業(yè)，預(yù)防或治療病原菌感染導(dǎo)致的疾病。由于抗生素的過(guò)量使用和在環(huán)境中的殘余，加快了微生物抵抗抗生素的進(jìn)化速率。其中，攜帶分解抗生素的抗性基因是微生物抵抗抗生素的主要途徑之一，抗性基因編碼的特殊酶將抗生素分解成無(wú)毒性的物質(zhì)，從而賦予微生物抗性[1-2]。

在自然界中，微生物通過(guò)基因融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等方式轉(zhuǎn)移或重排獲得抗性基因，造成耐藥性大幅上升[3]。β-內(nèi)酰胺酶基因(beta-lactamase，bla)是氨芐青霉素抗性基因，其編碼的β-內(nèi)酰胺酶被細(xì)菌分泌至胞外，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化β-內(nèi)酰胺環(huán)的水解，從而解除氨芐青霉素對(duì)細(xì)菌的毒性[4]。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside phosphotransferase,Aph)利用ATP作用于特定的游離羥基使其磷酸化，抑制卡那霉素與核糖體結(jié)合，從而失去抗菌活力，表現(xiàn)為卡那霉素耐藥性[5]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本學(xué)者Notomi建立的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)[6]。其核心是針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，60 ℃～65 ℃進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，1 h的時(shí)間即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增。此技術(shù)與PCR相比,對(duì)儀器要求較低，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，具有高特異性、高敏感性、實(shí)時(shí)定量和可視化檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)[7-9]。所以，LAMP技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種核酸檢測(cè)，特別是病原微生物的檢測(cè)，如致病性細(xì)菌、真菌和病毒等[10-11]。

本研究針對(duì)bla基因和Aph基因，建立特異的LAMP擴(kuò)增體系，以羥基萘酚藍(lán)[12](HNB)作為指示劑，優(yōu)化HNB濃度，檢測(cè)反應(yīng)靈敏度，驗(yàn)證該LAMP方法,成功實(shí)現(xiàn)環(huán)境微生物中抗性基因的可視化檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 大腸埃希氏菌E.coliTOP10，含bla基因的質(zhì)粒pET-32a，含有Aph基因的pET-28a質(zhì)粒,陜西理工大學(xué)功能基因組實(shí)驗(yàn)室制備保存；Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶，美國(guó)NEB公司產(chǎn)品；羥基萘酚藍(lán)，上海生化科技有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Alliance Chroma紫外凝膠成像分析系統(tǒng)，英國(guó)UVItec公司產(chǎn)品；Nanodrop-2000微量核酸蛋白檢測(cè)儀，美國(guó)Thermo scientific公司產(chǎn)品。

1.1.3 水樣 利用50 mL EP管，分別于漢江采集河水樣品，漢中本地2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集污水樣品，將采集的水樣置于冰盒，送回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI公布的抗性基因bla和Aph的DNA序列，使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Pri-mer Explorer V4(http ://primerexplorer.jp/e/)，遵循LAMP引物的設(shè)計(jì)原則，獲得針對(duì)目標(biāo)基因的2條外引物(F3和B3)和2條內(nèi)引物(FIP和BIP)(表1)，引物送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

表1 LAMP引物信息

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系 基于LAMP技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)基因的原理，設(shè)計(jì)擴(kuò)增bla基因和Aph基因的LAMP反應(yīng)體系。LAMP擴(kuò)增體系中加入模板DNA 1 μL(10 ng/μL)，10×buffer 2.5 μL，dNTP 4 μL，MgSO41.5 μL，引物FIP和BIP各2 μL (10 μmol/L)，引物F3和B3各0.5 μL (10 μmol/L)，1 μLBstDNA聚合酶(8 000 U/mL)，ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。將上述體系置于95 ℃水浴保持5 min，然后65 ℃保持1 h， 80 ℃滅活20 min終止反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)果可利用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或直接加入HNB可視化檢測(cè)。

1.2.3 HNB濃度優(yōu)化 LAMP體系中加入HNB，反應(yīng)前呈現(xiàn)紫羅蘭色，基因擴(kuò)增反應(yīng)后呈天藍(lán)色，合適的HNB濃度能準(zhǔn)確指示陽(yáng)性結(jié)果。我們?cè)O(shè)置0、50、100、120、150、200、250 μmol/L的HNB濃度梯度，分別配制LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系；同時(shí)設(shè)置相應(yīng)濃度的陰性對(duì)照。通過(guò)觀察對(duì)比試驗(yàn)組與對(duì)照組的顏色差異，篩選出HNB最佳濃度。

1.2.4 反應(yīng)體系靈敏度檢測(cè) 梯度稀釋質(zhì)粒DNA濃度102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，將1μL不同濃度的質(zhì)粒DNA加入25 μL LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系，并加入HNB顏色指示劑。反應(yīng)后觀察不同DNA濃度體系的顏色變化，確定反應(yīng)體系檢測(cè)目標(biāo)基因的靈敏度。

1.2.5 水體樣品中抗性基因快速檢測(cè) 分別采集漢江河水，本地A和B養(yǎng)殖場(chǎng)污水樣品，應(yīng)用LAMP反應(yīng)體系檢測(cè)不同樣品微生物是否攜帶bla基因和Aph基因。取采集獲得的水樣1 mL，8 000 r/min離心1 min收集水體中微生物，然后加入1 mL滅菌PBS，重懸微生物，離心后棄PBS。利用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取樣品中DNA，利用構(gòu)建的LAMP反應(yīng)體系，可視化檢測(cè)3種水樣中抗生素抗性基因。

2 結(jié)果

2.1 可視化LAMP檢測(cè)方法的建立

為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)引物的特異性和可視化檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，分別在LAMP擴(kuò)增體系中加入含抗性基因的質(zhì)粒DNA和相應(yīng)的引物為試驗(yàn)組，以滅菌水為模板作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，試驗(yàn)組中均有明顯的梯狀條帶，而對(duì)照組中無(wú)擴(kuò)增條帶(圖1)。此外，在擴(kuò)增體系中加入HNB(終濃度120 μmol/L)，試驗(yàn)組顏色由紫羅蘭色變成天藍(lán)色，而陰性對(duì)照呈現(xiàn)紫羅蘭色(圖1)。上述結(jié)果說(shuō)明LAMP能擴(kuò)增相應(yīng)抗性基因，HNB能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果可視化檢測(cè)。

2.2 HNB濃度優(yōu)化

合適的HNB濃度能準(zhǔn)確顯示擴(kuò)增結(jié)果，試驗(yàn)分別設(shè)置了0～250 μmol/L HNB濃度梯度的LMAP體系，以篩選最佳HNB濃度，優(yōu)化可視化檢測(cè)。在檢測(cè)bla基因的LAMP體系中，與水為模板的對(duì)照組比較，加入HNB的試驗(yàn)組的體系顏色均為天藍(lán)色，當(dāng)HNB濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，陰性對(duì)照體系亦呈天藍(lán)色，與試驗(yàn)組顏色差異較小。HNB的濃度為100、120、150 μmol/L時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組顏色差異明顯，尤其在濃度為100 μmol/L時(shí)顏色差異最為顯著，故選擇100 μmol/L的HNB為檢測(cè)bla的最佳濃度。檢測(cè)Aph的LAMP體系HNB最適濃度與其一致。

2.3 LAMP方法的靈敏性檢測(cè)

分別梯度稀釋攜帶抗性基因的質(zhì)粒DNA，設(shè)置模板濃度分別依次為102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL的LAMP擴(kuò)增體系。圖3結(jié)果表明，檢測(cè)bla的LAMP體系中，模板濃度為10-3ng/μL的體系呈天藍(lán)色，表現(xiàn)為陽(yáng)性，而模板為10-4ng/μL時(shí)顏色呈紫羅蘭色，表現(xiàn)為陰性，表明LAMP反應(yīng)體系檢測(cè)bla基因的下限為10-3ng/μL；檢測(cè)Aph基因的LAMP體系靈敏度檢測(cè)下限為1 ng/μL。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;bla+.bla基因陽(yáng)性反應(yīng)體系;bla-.bla基因陰性對(duì)照;Aph+.Aph基因陽(yáng)性反應(yīng)體系;Aph-.Aph基因陰性對(duì)照

-.陰性對(duì)照；+.試驗(yàn)組;1～7.0～250 μmol/L HNB

1-7.102 ng/μL～10-4 ng/μL

2.4 LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用

選取環(huán)境中水體樣本，應(yīng)用建立的LAMP可視化檢測(cè)不同樣本微生物中是否攜帶目標(biāo)抗生素抗性基因。分別來(lái)自漢江水、養(yǎng)殖場(chǎng)A和養(yǎng)殖場(chǎng)B污水的3個(gè)樣本中，只在養(yǎng)殖場(chǎng)B污水中檢測(cè)到bla基因，3個(gè)樣本中均未發(fā)現(xiàn)Aph基因。

S1.漢江水;S2.養(yǎng)殖場(chǎng)A污水;S3.養(yǎng)殖場(chǎng)B污水

3 討論

在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，抗生素的使用能有效預(yù)防飼養(yǎng)動(dòng)物被病原菌感染，以控制疾病的發(fā)生[13]。由于抗生素的大量使用及殘余抗生素排放至環(huán)境，加快環(huán)境微生物產(chǎn)生耐藥性的速率以增強(qiáng)其生存能力。其中，攜帶分解抗生素的抗性基因是環(huán)境微生物產(chǎn)生耐藥性的主要方式。同時(shí)，含抗生素的環(huán)境淘汰無(wú)耐藥性微生物，利于耐藥微生物增殖，耐藥基因在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，甚至產(chǎn)生具有多種抗生素耐藥性的超級(jí)細(xì)菌。因此，檢測(cè)環(huán)境微生物耐藥基因是評(píng)估環(huán)境質(zhì)量的重要方面之一。

常規(guī)PCR和熒光定量PCR是檢測(cè)目標(biāo)基因的重要分子生物學(xué)技術(shù)，但是這些技術(shù)需要基因擴(kuò)增儀，且只有專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員才能判讀結(jié)果，導(dǎo)致其成本高，檢測(cè)周期長(zhǎng)。LAMP是一種特殊基因擴(kuò)增技術(shù)，其利用鏈置換DNA聚合酶作用和特異引物對(duì)，在等溫條件下擴(kuò)增基因片段， 1 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因109倍增加，其不需要特殊儀器設(shè)備，具有成本低，反應(yīng)快，靈敏性高等優(yōu)勢(shì)。此外，在LAMP反應(yīng)體系中加入顏色指示劑，通過(guò)觀察顏色變化，直接判讀結(jié)果，不需要打開(kāi)反應(yīng)管，從而進(jìn)一步減少了交叉污染和氣溶膠產(chǎn)生污染的機(jī)會(huì)，使結(jié)果更準(zhǔn)確[14]。

魯曦等[15]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)出水產(chǎn)品和海產(chǎn)品中紅霉素、四環(huán)素和氯霉素等多種抗生素耐藥基因。馮世文等[16]建立了可視化檢測(cè)氟苯尼考耐藥基因floR的LAMP檢測(cè)方法。本研究針對(duì)常用抗生素氨芐青霉素和卡那霉素，其抗性基因分別是bla基因和Aph基因，建立可視化檢測(cè)這2種抗性基因的可視化LAMP體系，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果，驗(yàn)證引物的特異性。加入HNB顏色指示劑，反應(yīng)前體系呈紫羅蘭色，發(fā)生基因擴(kuò)增后呈天藍(lán)色，表現(xiàn)為陽(yáng)性。

合適的HNB濃度能準(zhǔn)確反映擴(kuò)增結(jié)果，所以篩選HNB最適濃度是可視化檢測(cè)的關(guān)鍵。Goto M等[12]發(fā)現(xiàn)120 μmol/L HNB能明顯區(qū)分陰性和陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果，張侃等[17]篩選150 μmol/L HNB為檢測(cè)偽狂犬病病毒的最佳濃度。本研究設(shè)置多個(gè)濃度HNB梯度，其中100、120、150 μmol/L HNB顏色變化均能有效區(qū)分陰性和陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)HNB濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，陰性和陽(yáng)性體系顏色差異較小，我們選擇100 μmol/L HNB作為最優(yōu)濃度。

LAMP技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)基因的靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR技術(shù)，與熒光定量PCR技術(shù)相當(dāng)[18]。王毅超等[19]比較發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)檢測(cè)解脲脲原體的靈敏度比普通PCR高1 000倍。鄧鵬程等[20]建立了檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺的LAMP方法，其敏感度為1 pg/μL。謝晶等[21]用LAMP檢測(cè)雞傳染性喉氣管炎病毒，最低濃度達(dá)到0.06 pg/μL，其靈敏度是普通PCR方法的100倍，可以適用臨床上的快速檢測(cè)和診斷。本研究建立的LAMP方法檢測(cè)bla基因的靈敏度為1 pg/μL，而檢測(cè)Aph基因的下限僅為1 ng/μL。利用該LAMP方法檢測(cè)3個(gè)不同來(lái)源水體微生物的抗性基因，結(jié)果顯示B養(yǎng)殖場(chǎng)污水中微生物攜帶bla基因，未發(fā)現(xiàn)Aph基因，可能與其檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低有關(guān)。后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)Aph基因的LAMP體系，增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。

本研究建立的檢測(cè)抗性基因bla和Aph可視化LAMP技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)抗性基因高效快速檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)果可直接判讀，避免打開(kāi)反應(yīng)管而引起氣溶膠污染，可為檢測(cè)抗生素耐藥微生物提供新的技術(shù)支撐。