郭日昌，梅 林，陳鳳如，黃彬華

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞厚街醫(yī)院胸外甲狀腺乳腺科，廣東 東莞 523000)

乳腺癌是指人乳腺組織細胞，尤其是乳腺上皮組織細胞，發(fā)生大面積癌變的一種惡性腫瘤疾病。其發(fā)病率與致殘率在女性惡性腫瘤中位居榜首，但也發(fā)生在男性中，且近幾年患者發(fā)病年齡持續(xù)呈現(xiàn)低齡化的趨勢[1-2]。乳腺癌不僅嚴重威脅患者的身體健康并帶來焦慮、煩躁、厭世等不良心理問題，而且可能會切除患者乳房，從而為患者隨后的日常生活帶來不便并進一步加深患者負面情緒。在惡性腫瘤中，由于外部和內(nèi)部因素的共同作用，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一種常見的現(xiàn)象[3]。

前哨淋巴結(jié)是指原發(fā)腫瘤出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時所經(jīng)的首個淋巴結(jié)。作為乳腺癌細胞最容易轉(zhuǎn)移的位置，其對判斷該疾病的實際變化有著至關(guān)重要的作用[4-5]。同時確定前哨淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移可以使患者避免腋窩淋巴結(jié)清掃手術(shù)(axillary lymph node dissection, ALND)，進而規(guī)避其帶來的一系列手術(shù)并發(fā)癥[6]。

人表皮生長因子2(human epidermal growth factor receptor 2, Her-2) 可以通過調(diào)控多條信號通路，促進細胞的生長分裂，調(diào)控細胞的生長與分化[7]。研究表明, HER-2的表達水平與腫瘤的分級、大小,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及藥物敏感性和預(yù)后密切相關(guān)[7-8]。HER-2受體陽性乳腺癌患者占全體乳腺癌患者的25%，表現(xiàn)出更強的浸潤性和更短的生存期。這些都提示HER-2表達水平與乳腺癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移可能具有強相關(guān)性。

本研究通過檢測2014年4月～2019年5月我院收治的乳腺癌患者原發(fā)病灶和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的HER-2基因表達水平與前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移水平，探究于乳腺癌前ER-2基因表達對哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性質(zhì)的影響情況。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2014年4月～2019年5月我院收治的乳腺癌患者96例。納入標準：①年齡20～70歲；②首次發(fā)病，具有完整的乳腺和前哨淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)；③由主治以上級別?？漆t(yī)師，通過病理檢查確診為乳腺癌；④患者臨床和病理資料齊全；⑤患者均為漢族女性；⑥根據(jù)《惡性腫瘤TNM分類法》和美國癌癥協(xié)會 (American Joint Committee on Cancer, AJCC) 第7版乳腺癌分期標準判斷腫瘤處于Ⅱ期；⑦患者意識清楚并可以通過語言或者文字表達;⑧事先告知患者檢測方案并獲得患者及其家屬的書面同意； 排除標準:①存在嚴重意識障礙和嚴重并發(fā)癥癥狀；②患有除乳腺癌、纖維癌和脂肪癌以外的癌癥；③病理資料不全或病理分型不明確者；④根據(jù)《惡性腫瘤TNM分類法》和AJCC第7版乳腺癌分期標準判斷腫瘤處于Ⅲ期或Ⅳ期；⑤患者曾被確診為乳腺癌且接受過ALND等相應(yīng)治療，為二次或多次發(fā)病者；⑥患者具有少數(shù)民族或其他國家的血統(tǒng)；⑦處于妊娠或哺乳狀態(tài)的患者；⑧患有嚴重精神疾病的患者；⑨具有嚴重的血液病和肝腎功能障礙者；⑩任何其他診斷治療禁忌者；檢測未獲得患者及其家屬的書面同意或其中途退出。

根據(jù)臨床及影像學(xué)檢查顯示的前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，將患者分為三組，無轉(zhuǎn)移組48例，低轉(zhuǎn)移組28例，高轉(zhuǎn)移組20例。無轉(zhuǎn)移組、低轉(zhuǎn)移組和高轉(zhuǎn)移組年齡、腫瘤直徑、絕經(jīng)比例和平均體重等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。詳見表1。

1.2檢測方法

1.2.1免疫組化法檢測原病灶的HER-2基因表達：采用免疫組織化學(xué)法對乳腺癌原病灶和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的HER-2的表達狀態(tài)進行檢測。針吸法獲得活檢的乳腺癌原病灶組織標本。使用4%中性 (磷酸緩沖) 福爾馬林固定液固定標本6 h后，將其石蠟包埋進行切片處理，每份切片厚度<5 μm。引用專用乳腺癌HER-2檢測試劑盒(免疫組化法)，而此次研究所引用的試劑盒由廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司提供，并定性檢測所有被選對象原病灶HER-2蛋白水平情況。其中含有抗HER-2蛋白鼠單克隆抗體、二抗I試劑、二抗II試劑、DAB色原、底物緩沖液和質(zhì)控片，原理為En Vision法。步驟如下：①用二甲苯?jīng)_洗石蠟切片脫蠟2次，每次間隔30 min。100%、95%、90%、85%、80%、70%的乙醇濃度自高至低依次對組織進行復(fù)水，每次間隔5 min，隨后將切片置于蒸餾水中5 min進行洗片，共進行3次。②用高壓對修復(fù)組織抗原。③切片滴加PBS 沖洗3次后滴加抗HER-2蛋白鼠單克隆抗體，4℃過夜。PBS 沖洗 3 次后滴加二抗Ⅰ試劑，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次后滴加二抗Ⅱ試劑，室溫下孵育10 min， PBS 沖洗3次。④切片滴加 DAB 色原溶液顯色，顯色后用自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封固。⑤使用質(zhì)控片設(shè)置陽性對照片和陰性對照片。

表1 三組患者的一般情況資料比較

1.2.2免疫組化法檢測前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的HER-2基因表達:采用免疫組織化學(xué)法對乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的HER-2的表達狀態(tài)進行檢測。用前哨淋巴結(jié)活檢法獲得的乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織標本。采取與原病灶處同樣的方法對低轉(zhuǎn)移組和高轉(zhuǎn)移組的前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處的HER-2蛋白進行定性檢測。

1.2.3熒光原位雜交法能對移速陽性標本進行檢測:根據(jù)下文提及的檢測標準，對存疑的標本取其他切片使用熒光原位雜交法進行進一步檢測。

1.2.3.1操作前準備:將4 μm切片于65℃下過夜烤片。 隨后與免疫組化法一樣將組織切片脫蠟和復(fù)水，于 50℃下用 30%[w/v]酸性亞硫酸鈉(購于美國Sigma公司)處理組織切片，30 min后使用2xSSC溶液(購于天津生化制品有限公司)對切片進行漂洗。向40 ml中性2xSSC加入美國Sigma公司提供的0.4 ml蛋白酶K儲存液，得到蛋白酶K工作液；在蛋白酶K工作液內(nèi)浸泡組織切片，在37℃環(huán)境下孵育20～30 min。然后將切片玻片依次置于-20℃預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和 100%乙醇中脫水，自然干燥玻片后置于56℃烤箱中預(yù)熱待用。

1.2.3.2標本的準備：標記玻片背面的雜交區(qū)域。用2xSSC稀釋為75%的甲酰胺變性液于73℃水浴箱中預(yù)熱30 min后，將玻片浸泡于該變性液中5 min，充分變性。隨后在零下20℃預(yù)冷的70%濃度乙醇、85%濃度乙醇和100%濃度乙醇內(nèi)分別置入玻片后梯度脫水。待自然干燥后，將其置于溫度在45℃的烤片機上進行預(yù)熱。

1.2.3.3探針配置：將2 μl的GLP HER-2/CSP17 探針(北京金菩嘉醫(yī)療科技公司)與1 μl的去離子水和7 μl的雜交緩沖液混勻，先置于73℃水浴箱中變性5 min，再移交至45℃水浴箱中備用。

1.2.3.4樣品雜交：將探針混合物滴于雜交區(qū)域后馬上蓋片封片，將其放置于鋪有浸濕紙巾的濕盒中，密封后于42℃保溫箱中過夜。

1.2.3.5洗滌樣品：在恒溫狀態(tài)下，向3個考普林瓶內(nèi)分別置入2xSSC稀釋為的 50%濃度的甲酰胺溶液，然后在46℃水浴箱內(nèi)放置盛有洗滌液的3個瓶子，預(yù)熱30 min。將移去蓋玻片的組織玻片立即置于第1個考普林瓶中，晃動玻片1～3 s，10 min后取出轉(zhuǎn)至第2個考普林瓶中，相同方法洗滌后轉(zhuǎn)入第3個考普林瓶中，操作相同。取出后再分別以 50 ml 2xSSC 溶液和0.1%NP-40 洗液(北京金菩嘉醫(yī)療科技公司)洗滌玻片， 置于暗處自然干燥。

1.2.3.6利用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：將15 μl DAPI復(fù)染劑滴加在最終樣本的雜交區(qū)域后，馬上用蓋玻片蓋上，然后放置在陰涼地靜置20 min，然后利用熒光顯微鏡進行觀察，但在觀察時應(yīng)對濾波片合理選擇。

1.3檢測標準:將染色完畢的標本置于光學(xué)顯微鏡10×物鏡下觀察，HER-2陽性癌細胞的細胞膜完全深著色。根據(jù)2014年發(fā)布的中國乳腺癌HER-2檢測指南[9]，將結(jié)果定義如下：①0：所有或>90%的腫瘤細胞完全不存在細胞膜著色；②1+為>10%的腫瘤細胞不完整淺著色；③2+為>10%的腫瘤細胞完整淺著色；④3+為>10%的腫瘤細胞完整強著色。3+可視為病灶處HER-2陽性，0～1+可視為病灶處HER-2陰性，2+需要通過熒光原位雜交法進行進一步判定。

17號染色體著絲粒顯示綠色熒光信號，HER-2基因顯示橘紅色熒光信號。若細胞核內(nèi)同時呈現(xiàn)綠色與橘紅色熒光信號則該細胞被視為HER-2陽性細胞。調(diào)整視野，計數(shù)30個細胞中陽性細胞的比例。若比例>2.2為陽性，若比例<1.8為陰性，若處于1.8～2.2兩者之間則擴大計數(shù)細胞范圍，直至比例>2.2或<1.8。若此方法下陽性[2+(+)]，2+標本方可歸為病灶處HER-2陽性，反之歸為病灶處HER-2陰性[2+(-)]。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)運用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用率(%)表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1原病灶的HER-2基因表達:各組原病灶的HER-2基因表達情況見表2。三組患者各檔人數(shù)比例均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。無轉(zhuǎn)移組的乳腺癌原病灶的HER-2基因陽性率(20.83%)顯著低于低轉(zhuǎn)移組(42.86%)與高轉(zhuǎn)移組(55.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且低轉(zhuǎn)移組陽性率顯著低于高轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 三組患者原病灶處的HER-2基因表達

2.2前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的HER-2基因表達：低轉(zhuǎn)移組和高轉(zhuǎn)移組前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的HER-2基因表達情況見表3。兩組患者除1+檔外，各檔人數(shù)比例均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低轉(zhuǎn)移組患者的乳腺癌轉(zhuǎn)移灶處HER-2基因陽性率為39.28%，顯著低于高轉(zhuǎn)移組的55%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 低轉(zhuǎn)移組和高轉(zhuǎn)移組患者前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處的HER-2基因表達[例(%)]

2.3原病灶與前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處HER-2基因表達對比：低轉(zhuǎn)移組與高轉(zhuǎn)移組患者的乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處HER-2基因陽性率與其對應(yīng)組的原病灶處陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，呈現(xiàn)較高的一致性。見表4。

表4 低轉(zhuǎn)移組和高轉(zhuǎn)移組患者原病灶與前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處HER-2陽性率對比[例(%)]

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤死因的榜首，在全球范圍內(nèi)占全部惡性腫瘤的22%，其高發(fā)病率、高致殘致死率、高復(fù)發(fā)率與低齡化發(fā)病和持續(xù)上升發(fā)病的趨勢使得其成為臨床研究的熱點。未育、未哺乳、月經(jīng)初潮較早、乳腺增生、乳腺腺體致密、物理因素、化學(xué)因素和家族遺傳史等皆是罹患乳腺癌的高危因素[10]。盡管男性也可能患乳腺癌，但由于生理結(jié)構(gòu)差異，其可能性遠小于女性。此外，由于相關(guān)觀點普及程度和社會觀念影響，男性本身察覺到患癌可能并就醫(yī)的可能性小。因此，男性患者人群過小，無法達到互相參照的樣本量，故本次實驗完全排除男性患者。研究顯示，不同民族乳腺癌患者HER-2陽性率和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[11]，考慮到患者樣本量的充足性，本次實驗只包含漢族患者。

乳腺癌中前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是常見現(xiàn)象，但并非所有的乳腺癌患者均出現(xiàn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。事實上，50%～70%的乳腺癌患者不出現(xiàn)前哨淋巴結(jié)。對無轉(zhuǎn)移患者實施ALND不僅不必要，且會帶來上肢水腫和運動障礙等一系列術(shù)后并發(fā)癥，并破壞淋巴結(jié)的免疫檢測功能，從而促進隱匿癌灶向遠處轉(zhuǎn)移。因此，研究影響乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的因素對于乳腺癌的控制病情和治愈有極高的臨床意義。前哨淋巴結(jié)活檢技術(shù)作為一種微創(chuàng)診斷技術(shù)，可以大幅避免ALND引起的相關(guān)并發(fā)癥。研究證明，僅接受前哨淋巴結(jié)活檢而不接受ALND的患者較接受ALND的患者而言，無病生存期和總生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但前者具有更好的長期生活質(zhì)量[12]，亦有研究證實前者具有更低的復(fù)發(fā)率。故本次實驗采用前哨淋巴結(jié)活檢法獲取前哨淋巴結(jié)組織進行HER-2基因表達檢驗。

免疫組化法測量HER-2表達操作簡便、成本低、得結(jié)果快，是廣泛應(yīng)用的理想定性檢測方法。但是由于其本身操作中蛋白容易受到破話和污染，會對結(jié)果的準確性造成較高的干擾。因此對于2+的樣本需要采用原位雜交法進行進一步的測定。熒光原位雜交法測量主體為HER-2 基因而非HER-2蛋白，因此具有更高的穩(wěn)定性，實驗操作的影響相對降低，同時，其還可用于定量檢測。但是熒光原位雜交法操作繁復(fù)、成本高昂、操作流程時間過長，因此在大多數(shù)相關(guān)研究中仍主要應(yīng)用于對免疫組化法存疑樣本檢測的補充，而非直接應(yīng)用。免疫組化法仍然是測量HER-2表達的首選。

乳腺癌的具體的發(fā)病機制目前尚不清晰，仍處于研究探索階段。但隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展尚,多項研究表明,多種細胞因子及基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。HER-2是坐落于17號染色體上的人類原癌基因，具有酪氨酸酶活性，可以作為多種腫瘤的調(diào)控因子，影響腫瘤的形態(tài)特點、生長方式、惡性程度、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和對內(nèi)分泌治療的敏感程度。它也被證實可以促進乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。HER-2陽性乳腺癌亦表現(xiàn)出更強的浸潤性、更短的生存期和更差的預(yù)后效果。本實驗顯示，乳腺癌原病灶和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的HER-2基因表達水平與乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移水平正相關(guān)，提示HER-2水平可以作為良好的前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測參數(shù)，預(yù)測其是否轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移程度。國內(nèi)外多項研究顯示，多項乳腺癌相關(guān)受體表達量在原病灶和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處的表達不一致[13]。但國內(nèi)多項研究也展示了HER-2在原病灶和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處的表達具有較好的一致性[11,14,15]，這與本研究結(jié)果一致。低轉(zhuǎn)移組和高轉(zhuǎn)移組的患者原病灶和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處的表達均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示原病灶處的HER-2分子水平已經(jīng)可以很好地反映前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處的HER-2分子水平，這對于臨床研究和治療具有重要的參考意義。

總之，本實驗通過免疫組化法和熒光原位雜交法，測量不同轉(zhuǎn)移性質(zhì)之下的初發(fā)女性乳腺癌患者原病灶和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處的HER-2水平，發(fā)現(xiàn)其具有良好的正相關(guān)性，且原病灶和前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶處的HER-2水平呈現(xiàn)較好的一致性。這提示建立以原病灶HER-2表達水平為基礎(chǔ)的乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性質(zhì)預(yù)測系統(tǒng)具有可行性，為乳腺癌分子靶向治療提高了較高的參考依據(jù)