李曉晴，馮 新，陳雪諾，馬 戰(zhàn)，姜 政

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400016)

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率一直居高不下。由于缺乏腫瘤標志物和特異性的癥狀與體征，早期診斷以及早期治療存在一定的困難。盡管近年來胃癌的診斷和治療取得了很大進展，但由于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，胃癌患者的預(yù)后仍然較差。目前，腫瘤血清標志物如癌胚抗原(CEA)、胃蛋白酶原、幽門螺桿菌抗體以及胃鏡和組織病理學檢查是用于診斷和評估疾病的主要手段，但這些診斷方法對早癌的檢出率較低[1]。因此，尋求可用于胃癌早期檢測和大規(guī)模篩選的生物標志物顯得尤為重要。

微小RNA(miRNA)是具有17～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼調(diào)節(jié)RNA，其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)中起重要作用[2]。由于miRNA存在于涉及腫瘤的基因組區(qū)域中，故越來越被認為是腫瘤診斷和預(yù)后的潛在生物標志物。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤中發(fā)揮致癌或抑癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b-5p參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤[3]、肝癌[4]、結(jié)腸癌[5]、肺癌[6]、胰腺癌[7]等多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展。然而，有關(guān)miR-181b-5p在胃癌中的表達和作用機制卻罕有報道。

GEO(Gene Expression Omnibus)是由美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建并維護的基因表達數(shù)據(jù)庫，是當今最大、最全面的公共基因表達數(shù)據(jù)資源。本文通過GEO數(shù)據(jù)庫的miRNA芯片數(shù)據(jù)，結(jié)合統(tǒng)計學和生物信息學分析方法，研究miR-181b-5p在胃癌中的表達情況，并初步探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料：在GEO 數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載胃癌的 miRNA 數(shù)據(jù)，檢索詞為“gastric cancer”，“microRNA”。納入標準：①胃癌的miRNA數(shù)據(jù)物種為人類；②有腫瘤組和正常對照組；③樣本數(shù)量超過2例；④樣本數(shù)據(jù)可以用來計算。排除標準：①樣本為血液或腹水的；②樣本是胃癌細胞系的；③樣本中無miR-181b-5p相關(guān)數(shù)據(jù)；④樣本中有其他干擾因素。

1.2方法

1.2.1數(shù)據(jù)提取和統(tǒng)計學處理：下載miR-181b-5p的表達數(shù)據(jù)，用SPSS 23.0分析數(shù)據(jù)，采用獨立樣本t檢驗，繪制ROC曲線來檢驗miR-181b-5p的診斷價值。Review Manager 5.3進行Meta分析，卡方檢驗和I2檢驗用于判斷數(shù)據(jù)的異質(zhì)性，若I2<25%，表明異質(zhì)性較??；25%≤I2<50%，表明異質(zhì)性中等；P<0.05或I2≥ 50%，表明異質(zhì)性高。若異質(zhì)性小或中等，使用固定效應(yīng)模型分析；若異質(zhì)性大,使用隨機效應(yīng)模型分析。繪制森林圖檢驗數(shù)據(jù)有無偏移，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.2.2生物信息學分析：采用MirDB[8]、miRWalk[9]、Pictar[10]、TargetScan[11]、Mirtarbase[12]、DIANAmicroT[13]預(yù)測miR-181b-5p的靶基因，預(yù)測的結(jié)果取交集，納入至少被三個平臺預(yù)測到的靶基因，從而減少軟件預(yù)測的假陽性率。對全部納入的潛在靶基因用DAVID在線工具[14]進行GO功能和KEGG通路分析。

2 結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計分析結(jié)果：從GEO數(shù)據(jù)庫中收集到5個miRNA芯片數(shù)據(jù)集：GSE28700、GSE30070、GSE54397、GSE78091、GSE93415，表達數(shù)據(jù)均已經(jīng)過標準化處理，結(jié)果見圖1，其中GSE30070、GSE54397、GSE93415數(shù)據(jù)集中胃癌組織的miR-181b-5p表達水平均值高于正常組織，且差異有統(tǒng)計學意義(P值分別是P=0.0455、P=0.0027、P<0.001)。3個數(shù)據(jù)集的ROC曲線見圖2，從GSE30070、GSE93415數(shù)據(jù)的ROC曲線可以看出，miR-181b-5p對胃癌有一定的診斷價值。

圖1 5個GEO數(shù)據(jù)集中miR-181b-5p在胃癌組織和正常組織的表達水平

圖2 3個GEO數(shù)據(jù)集中miR-181b-5p的ROC曲線

2.2Meta分析結(jié)果：對5個miRNA芯片數(shù)據(jù)集中miR-181b-5p的表達數(shù)據(jù)進行meta分析，異質(zhì)性檢驗示P<0.05，I2=83%，異質(zhì)性大,應(yīng)用隨機效應(yīng)模型分析，SMD(標準±均數(shù)差)為 1.09(95%CI:0.29～1.89，P<0.0001)，Meta分析顯示胃癌和正常胃組織的 miR-181b-5p的表達水平有差異，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。圖3為繪制的森林圖。

圖3 miR-181b-5p在胃癌和正常胃組織中表達水平的森林圖

2.3生物信息學分析結(jié)果： 通過6個miRNA靶基因預(yù)測平臺結(jié)果取交集后，共得到145個miR-181b-5p潛在的靶基因。各項結(jié)果見表1。GO功能分析結(jié)果表明，靶基因的功能主要為轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細胞增殖和細胞周期的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合的調(diào)節(jié)等方面，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。KEGG通路分析表明，靶基因主要涉及的生物學通路為：背腹軸形成、腫瘤miRNA、雌激素信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、Fox O信號通路、MAPK信號通路、腫瘤的中心碳代謝、HTLV-I感染等，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 GO功能和KEGG通路分析結(jié)果各項預(yù)測的前10項

3 討論

胃癌是由于多個基因發(fā)生不同遺傳變化而導致的多步驟的結(jié)果。由于缺乏高靈敏度和非侵入性的生物標志物，導致胃癌的診治和預(yù)后未得到明顯改善[15]。盡管許多研究一直在不斷地探討胃癌發(fā)生、發(fā)展的機制，但具體的分子機理仍未完全闡明。為了更深入地了解胃癌的分子機制，從miRNA層面分析其調(diào)控的生物學過程和功能，對腫瘤的診治有重要意義。miRNA可以通過分泌外泌體顆粒從癌細胞釋放到體液中，如血清、血漿、尿液、羊水和胃液等[16]，這可以保護它們免受核糖核酸酶(RNase)的降解。在一定的生理狀態(tài)下，來源于不同細胞的miRNA在體液中會有不同的表達模式[16-17]。因此，miRNA可能是診斷胃癌有效的非侵入性生物標志物。

miR-181b-5p在許多癌癥中的基因表達、分子調(diào)控等方面都發(fā)揮著重要的作用。Shi L等人的研究[3]指出，miR-181b-5p作為腫瘤抑制因子觸發(fā)生長抑制，誘導細胞凋亡，抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲，異常下調(diào)的miR-181b-5p可能是導致人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵因素。Wang B.指出上調(diào)的miR-181b-5p會促進肝癌的生長、遷移和侵襲[4]。Nakajima G等人發(fā)現(xiàn)miR-181b-5p在結(jié)腸癌組織中過表達，通過調(diào)控細胞信號傳導和細胞周期控制等方面促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。Tian F等證明miR-181b-5p在肺鱗狀細胞癌中負調(diào)控RASSF1和PIK3R1的表達，而RASSF1和PIK3R1直接參與非小細胞肺癌的發(fā)生[6]。Tomihara H等人的研究[7]表明，ETS1是miR-181b-5p的靶標，與胰腺導管腺癌的預(yù)后有關(guān)。關(guān)于miR-181b-5p在胃癌中的表達和機制的研究卻少有文獻報道，國內(nèi)的一項研究報道了對12例胃癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織進行微陣列研究，結(jié)果表明miR-181b在胃癌組織中異常過表達[18]。同樣的，還有一項國內(nèi)研究也通過RT-PCR法檢測了46例胃癌患者、27例胃癌前病變患者及21例健康人外周血漿中miR-181b的表達水平，結(jié)果表明在胃癌和胃癌前病變患者中miR-181b表達明顯增加[19]。但是在另一項研究中，miR-181b在胃癌細胞中的表達水平明顯低于正常組織細胞，差異有統(tǒng)計學意義[20]。這些研究表明，目前關(guān)于miR-181b-5p與胃癌的關(guān)系和作用機制尚不明確，仍需進一步的探索。

本研究通過在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索含有miR-181b-5p的數(shù)據(jù)集，比較miR-181b-5p在胃癌組織和正常組織中的表達水平，用統(tǒng)計學分析和Meta分析方法，發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織的 miR-181b-5p的表達水平有差異，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008)，表明對miR-181b-5p胃癌有一定的診斷價值。同時結(jié)合多個靶基因預(yù)測平臺得到145個miR-181b-5p的靶基因，盡可能減少預(yù)測的假陽性。對靶基因進行GO功能分析，得到靶基因主要富集在轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細胞增殖和細胞周期的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合的調(diào)節(jié)等方面；KEGG通路分析顯示其主要涉及背腹軸形成、腫瘤miRNA、雌激素信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、Fox O信號通路、MAPK信號通路、腫瘤的中心碳代謝等。本研究結(jié)合多個GEO數(shù)據(jù)集進行分析，結(jié)果較為可靠，這為胃癌的診治提供了一些新的思路。但仍存在一些不足，如納入miRNA數(shù)據(jù)集的異質(zhì)性較大、芯片測序及標準化處理的方法不同、需要進一步的實驗來驗證結(jié)果等。

總之，miR-181b-5p的上調(diào)與胃癌有密切的聯(lián)系，對胃癌的診斷可能有重要的意義，未來需要更多多中心、大樣本的實驗來進一步驗證。