馬璐璐，張璐莎，李春曉，張麗媛，楊文杰，方樂(lè)玉，王倩怡，陳 璐，王 虹

疏血通注射液臨床上用于治療急性期腦梗死，中醫(yī)辨證為瘀血阻絡(luò)所致的缺血性中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)急性期[1]。缺血性腦中風(fēng)是由于動(dòng)脈血管壁病變，血液成分改變，形成血栓，阻塞腦的供血?jiǎng)用}，缺血缺氧所致的局限性腦組織缺血性壞死或軟化，從而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損[2]。在血栓形成中血小板活化起重要作用[3]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，疏血通注射液可以通過(guò)抗血小板活化達(dá)到抗凝、溶栓效果[4]，但其抗血小板活化作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)模擬缺氧及氧化應(yīng)激環(huán)境，觀察疏血通注射液對(duì)血小板功能，包括對(duì)血小板聚集、黏附、活化的影響，并探討其潛在的作用機(jī)制，揭示其科學(xué)內(nèi)涵，指導(dǎo)臨床科學(xué)合理用藥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，雄性，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。

1.2 藥品與試劑 疏血通注射液，規(guī)格：2 mL，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20010100，牡丹江友博藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；過(guò)氧化氫(H2O2)，規(guī)格：30 g/L，衛(wèi)生許可證號(hào)：贛衛(wèi)消證字(2010)第0022號(hào)，江西草珊瑚消毒用品有限公司生產(chǎn)；二磷酸腺苷(ADP)，批號(hào)SLBN0134V，美國(guó)Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)；熒光探針CM-H2DCFDA、羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)；APC anti-mouse/rat CD62p antibody，美國(guó) Biolegend 公司生產(chǎn)；GAPDH、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(p-ERK5)、p70核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)、磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶(p-P70S6K)，美國(guó)CST公司生產(chǎn)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；水合氯醛，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；改良臺(tái)式液、改良臺(tái)式液(無(wú)鈣)，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；檸檬酸、檸檬酸銨、葡萄糖、氯化鐵，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司生產(chǎn)；Flex Station?3酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Device公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司生產(chǎn)；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司生產(chǎn)；64R型低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；超靈敏多功能成像儀，美國(guó)GE公司生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血小板懸液的制備 SD大鼠，5%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血10 mL，放入盛有ACD(檸檬酸38 mmol/L 、檸檬酸鈉75 mmol/L、葡萄糖124 mmol/L)的1.5 mL離心管中搖勻，1 200 r/min離心10 min，取上清部分，即為富血小板血漿PRP，3 000 r/min離心10 min，沉淀部分即為血小板，在血小板改良臺(tái)式液(無(wú)鈣)中洗2次，用改良臺(tái)式液稀釋成適當(dāng)濃度，使其吸光度值在1左右。

1.4.2 微孔法檢測(cè)血小板聚集率 分離血小板，檢測(cè)20 μmol/L ADP、2.5 mmol/L 花生四烯酸(AA)、0.4 U/mL凝血酶(Thrombin)誘導(dǎo)的血小板聚集率以及加入不同比例配置的疏血通注射液(1∶32、1∶64、1∶128)后的聚集率。用微孔法測(cè)血小板聚集率，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm處樣品的OD值。

1.4.3 分組及給藥 本研究包括兩種模型，即1% O2誘導(dǎo)的缺氧模型和500 μmol/L H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型，37 ℃孵育10 min。血小板分為空白對(duì)照組、模型組、疏血通注射液低濃度組、疏血通注射液中濃度組、疏血通注射液高濃度組。模型組及空白對(duì)照組給予Buffer A(130 nmol/L氯化鈉、10 mmol/L檸檬酸鈉、9 mmol/L碳酸氫鈉、6 mmol/L葡萄糖、0.9 mmol/L氯化鎂、0.81 mmol/L磷酸二氫鉀、10 mmol/L Tris-base)，疏血通注射液低、中、高濃度組分別將疏血通注射液用Buffer A按1∶12.8、1∶6.4、1∶3.2比例稀釋為10×工作液待用。

1.4.4 血小板在纖維蛋白原上的黏附 準(zhǔn)備載玻片，包被50 μg/mL纖維蛋白原溶液150 μL，4 ℃孵育過(guò)夜，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗去未結(jié)合的纖維蛋白原，血小板與生理鹽水、不同比例稀釋的疏血通注射液于37 ℃孵育20 min，1% O2或H2O2誘導(dǎo)10 min，取血小板懸液150 μL加到包被有纖維蛋白原的載玻片上，37 ℃孵育20 min，4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS洗3次，除去多余的多聚甲醛，采用鬼筆環(huán)肽對(duì)血小板避光標(biāo)記20 min，熒光顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取視野拍照，Image J軟件測(cè)量血小板面積。

1.4.5 血小板活性氧(ROS)檢測(cè) 分離血小板，分別與生理鹽水、低中高濃度的疏血通注射液于37 ℃，孵育20 min，1% O2或H2O2于37 ℃孵育10 min，與10 μmol/L CM-H2DCFDA，37 ℃避光孵育20 min，PBS洗3次，用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)528 nm處檢測(cè)各組血小板平均熒光強(qiáng)度。

1.4.6 血小板膜蛋白CD62p表達(dá)的檢測(cè) 分離血小板，分別與生理鹽水、不同比例稀釋的疏血通注射液于37 ℃孵育20 min，1%O2或H2O2于37 ℃，孵育10 min，加入CD62p-APC抗體，室溫避光孵育30 min，加入500 μL 1%多聚甲醛，充分混勻，用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)血小板CD62p的熒光強(qiáng)度。

1.4.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)p-P70S6K、P70S6K、p-ERK5、ERK5蛋白表達(dá) 分離血小板，分別與生理鹽水、不同濃度的疏血通注射液于37 ℃孵育20 min，1%O2或H2O237 ℃孵育10 min，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5%BSA的TBST溶液封閉3 h，分別加入p-P70S6K、P70S6K、p-ERK5、ERK5一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜4次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，TBST洗膜4次，每次10 min。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，圖像掃描分析。用Image J軟件對(duì)各蛋白條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 疏血通注射液對(duì)ADP、AA、Thrombin誘導(dǎo)大鼠血小板聚集的影響 疏血通注射液中濃度組和高濃度組對(duì)ADP、AA、Thrombin誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集有抑制作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；疏血通注射液低濃度組對(duì)AA誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集有抑制作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖1。

2.2 疏血通注射液對(duì)大鼠血小板黏附的影響 在1% O2誘導(dǎo)的低氧損傷模型中，疏血通注射液低濃度組、中濃度組和高濃度組降低了血小板與膠原的黏附，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見圖2。在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中，疏血通注射液低濃度組、中濃度組和高濃度組降低了血小板與膠原的黏附，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見圖3。

與模型組比較，＊ P<0.05；# P<0.01。

與模型組比較，＊ P<0.001。

與模型組比較，＊ P<0.001。

2.3 疏血通注射液對(duì)大鼠血小板ROS水平的影響 在1% O2誘導(dǎo)的低氧損傷模型中，疏血通注射液低中濃度組和高濃度組降低了ROS的產(chǎn)生，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4A。在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中，疏血通注射液低濃度組、中濃度組和高濃度組降低了ROS的產(chǎn)生，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4B。

與模型組比較，＊ P<0.05。

2.4 疏血通注射液對(duì)大鼠血小板CD62p表達(dá)的影響 在1% O2誘導(dǎo)的低氧損傷模型中，疏血通注射液中濃度組和高濃度組降低了CD62p的表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5A。在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中，疏血通注射液低濃度組和中濃度組降低了CD62p的表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5B。

與模型組比較，＊ P<0.05。

2.5 疏血通注射液對(duì)血小板p-ERK5、p-P70S6K蛋白表達(dá)的影響 在1% O2誘導(dǎo)的低氧損傷模型中，疏血通注射液低、中、高濃度組ERK5磷酸化以及P70S6K磷酸化降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖6A、6B。在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中，疏血通注射液中、高濃度組ERK5磷酸化降低。詳見圖7A；疏血通注射液高濃度組可降低P70S6K磷酸化，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖7B。

與模型組比較，＊ P<0.05。

與模型組比較，＊ P<0.05。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，疏血通注射液可抑制ADP、Thrombin、AA誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制缺氧及氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血小板活化，表明疏血通注射液具有抗血小板、抗血栓的作用。

缺血性腦中風(fēng)最常見的發(fā)病機(jī)制為動(dòng)脈粥樣硬化，血小板在斑塊破裂時(shí)通過(guò)凝血酶原的暴露而激活[5]，促進(jìn)血栓形成、腦血管閉塞，最終導(dǎo)致缺血性腦中風(fēng)的發(fā)生[6]。血小板活化與腦缺血缺氧后繼發(fā)性腦損傷有關(guān)，腦梗死后，缺血缺氧微環(huán)境中炎性因子和ROS均迅速增加，導(dǎo)致血小板持續(xù)活化，活化的血小板可以釋放組織因子及炎性因子，進(jìn)而激活凝血纖溶系統(tǒng)，在缺血區(qū)募集免疫細(xì)胞，加重心腦血管損傷[7]。也有研究表明，高原地區(qū)人群因長(zhǎng)期在缺氧環(huán)境下易形成血栓[8]。機(jī)體正常的新陳代謝會(huì)產(chǎn)生活性物質(zhì)，維持機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，但過(guò)多的活性物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，對(duì)機(jī)體造成損傷[9-10]。ROS家族中的H2O2是機(jī)體氧化代謝的產(chǎn)物，能夠刺激血小板活化[11]。

血小板作為最小的血液成分，在血栓形成和止血中起中樞介質(zhì)的作用。在血管內(nèi)皮受到損傷時(shí)，皮下基質(zhì)蛋白(如膠原或黏連蛋白)或內(nèi)源性激動(dòng)劑(如ADP)暴露于循環(huán)中，與血小板表面膜上糖蛋白受體相互作用，觸發(fā)黏附[12-14]，黏附的血小板進(jìn)一步活化周圍血小板，使其釋放α顆粒、致密顆粒內(nèi)容物、溶菌酶等，經(jīng)歷偽足形式的形狀變化，聚集形成多聚體。ROS在血小板活化中的作用已被研究，早期報(bào)道主要表明ROS超載誘導(dǎo)血小板活化[15-16]。CD62p儲(chǔ)存于血小板的α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞中，在血小板活化和脫顆粒過(guò)程中重新分布到質(zhì)膜上，并介導(dǎo)活化的內(nèi)皮細(xì)胞或血小板與白細(xì)胞的相互作用。有研究表明，疏血通注射液具有抗血小板[1]、抗凝[17]、促纖溶[18]、抗炎[19]和促神經(jīng)保護(hù)[20]等作用。本研究結(jié)果顯示，疏血通注射液可抑制多種誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制缺氧或H2O2誘導(dǎo)的血小板與膠原蛋白的黏附、ROS水平以及CD62p的釋放，提示疏血通注射液可抑制血小板活化。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激敏感[21]，是血小板信號(hào)通路的重要組成部分。在血小板中發(fā)現(xiàn)了MAPK家族成員ERK5，ERK5是一種對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感的蛋白激酶，在心腦缺血期間作為ROS的感應(yīng)器，促進(jìn)氧化還原、血小板信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]，有研究表明，在缺氧、富含ROS的環(huán)境中激活并介導(dǎo)受體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)ERK5調(diào)節(jié)心肌梗死后血小板蛋白表達(dá)，其下游P70S6K是血小板活化所需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件[23]，ERK5缺陷小鼠的血小板在心肌梗死后活化減弱，與P70S6K在心肌梗死后表達(dá)降低一致[24]。本研究結(jié)果顯示，疏血通注射液可抑制ERK5和P70S6K的磷酸化，提示疏血通注射液抑制血小板活化可能與其抑制ERK5/P70S6K信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，疏血通注射液可通過(guò)抑制ERK5/P70S6K信號(hào)通路，抑制缺氧及H2O2誘導(dǎo)的血小板聚集、黏附與釋放，從而抑制血栓形成，為疏血通注射液的抗血小板治療提供了科學(xué)依據(jù)。