楊曉忱，張 云，劉詠梅，王 階

隨著降壓藥、降脂藥接連上市及廣泛應(yīng)用，心腦血管疾病的發(fā)生率和病死率在歐美等西方國(guó)家逐漸降低，而該病發(fā)病率、病死率在我國(guó)近年來仍不斷增加。我國(guó)心血管事件年發(fā)病率為50/10萬，而腦卒中年發(fā)病率為250/10萬，是心血管事件的5倍[1]，已成為我國(guó)居民的首位死因[2]。高血壓作為心腦血管疾病共同的主要危險(xiǎn)因素之一，目前其治療率、控制率仍處于較低水平。因此，進(jìn)一步尋求和探索導(dǎo)致我國(guó)心腦血管疾病高發(fā)和持續(xù)發(fā)展的可干預(yù)危險(xiǎn)因素具有重要意義。補(bǔ)腎降壓方是臨床有效降壓經(jīng)驗(yàn)方，由生地、杜仲、山萸肉、天麻、丹皮、澤瀉、三七、山楂等組成，臨床應(yīng)用30余年，相關(guān)臨床研究獲得院內(nèi)倫理審查批號(hào)(2019-186-KY-01)及國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的藥物臨床試驗(yàn)批件(ChiMCTR1900002876)，主要用于治療1級(jí)、2級(jí)原發(fā)性高血壓，臨床療效明顯。本團(tuán)隊(duì)前期研究中對(duì)補(bǔ)腎降壓方治療高血壓的機(jī)制進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究[3-11]，研究表明，補(bǔ)腎降壓方降壓效果穩(wěn)定，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝與水鈉代謝、逆轉(zhuǎn)靶器官損害的作用，其機(jī)制與上調(diào)miR-1抑制胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路，調(diào)節(jié)lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號(hào)通路，抑制內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)凋亡，抑制核因子-κB(NF-κB)通路，抑制炎癥反應(yīng)等有關(guān)。但由于復(fù)方研究的復(fù)雜性，其機(jī)制研究面臨一定的困難，作用機(jī)制研究尚停留在經(jīng)典藥理學(xué)層面，缺乏系統(tǒng)性。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索補(bǔ)腎降壓方藥效學(xué)及其治療高血壓的多靶點(diǎn)機(jī)制。通過運(yùn)用整合藥理學(xué)中藥平臺(tái)[12-14]，構(gòu)建補(bǔ)腎降壓方的藥物靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)及 “中藥-化學(xué)成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”多維多系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，挖掘補(bǔ)腎降壓方降壓作用的關(guān)鍵靶標(biāo)和信號(hào)通路，以期為補(bǔ)腎降壓方治療高血壓提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 補(bǔ)腎降壓方活性成分的搜集與篩選 本研究重點(diǎn)運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)，該平臺(tái)主要分析藥物、靶標(biāo)與疾病之間的關(guān)系[15]。網(wǎng)址為http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，BSJY復(fù)方組成：杜仲、天麻、生地、丹皮、澤瀉、三七、山楂、山萸肉。主要提取口服生物利用度(OB)、生物半衰期(HL)、藥物相似度(DL)等化合物藥代動(dòng)力學(xué)特征。若TCMSP未收錄，則使用TCMID數(shù)據(jù)庫[16]，該數(shù)據(jù)庫主要收集中醫(yī)方劑、草藥和草藥成分及現(xiàn)代藥理學(xué)信息。通過2個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得補(bǔ)腎降壓方成分后，以吸收A、分布D、代謝M、排泄E為標(biāo)準(zhǔn)，即ADME；本方屬于口服制劑，設(shè)置該參數(shù)為OB≥30%，HL≥4 h，DL≥0.19，以排除無法在體內(nèi)正常代謝成分的干擾。

1.2 補(bǔ)腎降壓方活性成分及相關(guān)靶標(biāo)的檢索 收集補(bǔ)腎降壓方組成中藥的化學(xué)活性成分，然后通過“TCMSP靶向預(yù)測(cè)”界面平臺(tái)集成的藥庫數(shù)據(jù)庫，與補(bǔ)腎降壓方所含化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比，預(yù)測(cè)補(bǔ)腎降壓方中所含活性成分的潛在靶標(biāo)，選擇可能性score≥0.8。

1.3 補(bǔ)腎降壓方活性成分靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 對(duì)Therapeutic Target Database(TTD)、Drugbank(版本5.0)[17]等生物學(xué)數(shù)據(jù)庫資源中高血壓相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行檢索[18]，輸入“hypertension”作為關(guān)鍵詞，收集其疾病靶標(biāo)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果合并、去重后作為疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫備用。前者中篩選出已證實(shí)的高血壓相關(guān)疾病靶點(diǎn)或上市的高血壓臨床藥物相關(guān)靶點(diǎn)，與作用相關(guān)的補(bǔ)腎降壓方靶點(diǎn)之間進(jìn)行提取，建立藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間作用網(wǎng)絡(luò)，以及成分靶點(diǎn)-疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Venn Diagram韋恩圖對(duì)疾病靶點(diǎn)和成分靶點(diǎn)進(jìn)行分析，探尋中藥如何通過共有靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。

1.4 補(bǔ)腎降壓方成分靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析 本研究對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中的評(píng)價(jià)采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)[19]，包括自由度(degree)：生物功能參與越多，degree越大；平均最短路徑長(zhǎng)度(average shortest path length)：值越小說明在網(wǎng)絡(luò)中越重要；靠近中心性(closeness centrality)、介數(shù)(betweenness centrality)：在網(wǎng)絡(luò)信息中發(fā)揮越重要的作用，節(jié)點(diǎn)值越大。篩選高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)、中藥靶點(diǎn)與疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Hub節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 “中藥-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與潛在分子機(jī)制挖掘 為了更加直觀地反映補(bǔ)腎降壓方中組分-靶標(biāo)和通路之間的關(guān)系，使用DAVID v 6.8數(shù)據(jù)庫[20]構(gòu)建補(bǔ)腎降壓方成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)，核心靶點(diǎn)運(yùn)用基因本體(GO)功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01) 及排名前20位的通路，針對(duì)關(guān)鍵通路(關(guān)鍵核心靶標(biāo)參與)，使用 Cytoscape工具構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理圖進(jìn)行展示。

2 結(jié) 果

2.1 補(bǔ)腎降壓方所含成分及其預(yù)測(cè)靶標(biāo)概況 通過整合藥理學(xué)平臺(tái)中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫共匯集了補(bǔ)腎降壓方中8種單味中藥共93種可被口服吸收的化學(xué)成分，其中杜仲13個(gè)、地黃10個(gè)、天麻23個(gè)、山茱萸16個(gè)、牡丹皮9個(gè)、澤瀉10個(gè)、三七7個(gè)、山楂5個(gè)。根據(jù)藥物數(shù)據(jù)庫中藥物的相似性評(píng)分，≥0.8時(shí)這種藥物被認(rèn)為與補(bǔ)腎降壓方中所含的化學(xué)成分具有高度相似性。將得到補(bǔ)腎降壓方“成分-靶標(biāo)”信息與Drugbank和TTD等生物學(xué)數(shù)據(jù)庫資源中高血壓相關(guān)靶標(biāo)取交集，運(yùn)用韋恩圖分析疾病靶點(diǎn)和成分靶點(diǎn)(見圖1)。由此產(chǎn)生的組分-目標(biāo)被分配給組分和目標(biāo)以及補(bǔ)腎降壓方中含有藥物，以獲得每一種藥物對(duì)應(yīng)的目標(biāo)信息(見表1、表2)。

圖1 補(bǔ)腎降壓方與高血壓疾病靶點(diǎn)韋恩圖

表1 補(bǔ)腎降壓方中藥-成分-靶標(biāo)基本信息

表2 補(bǔ)腎降壓方活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與高血壓疾病相關(guān)靶點(diǎn)共有交集

2.2 補(bǔ)腎降壓方成分靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及潛在分子機(jī)制挖掘 高血壓疾病靶點(diǎn)與補(bǔ)腎降壓方藥物靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建提取到566對(duì)相互作用和146個(gè)節(jié)點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape并根據(jù)degree對(duì)候選靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，共篩選到關(guān)鍵靶點(diǎn)75個(gè)，相互作用聯(lián)系146個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，針對(duì)結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(見圖2)；選取自由度排名前20位的靶點(diǎn)(見表3)。結(jié)果顯示，前20個(gè)靶點(diǎn)中自由度最大的靶點(diǎn)為蛋白Tp非受體1型(PTPN1)，自由度為29；其次為羥類固醇11-β脫氫酶2(HSD11B2)，自由度為28。自由度越大說明該靶點(diǎn)與更多靶點(diǎn)存在靶向關(guān)系，在網(wǎng)絡(luò)中具有重要的作用。而平均最短路徑的靶點(diǎn)依次為5-羥色胺受體2A(HTR2A)、PTPN1、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)等，平均最短路徑反映靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的距離，距離越近則與其他靶點(diǎn)關(guān)系越密切，在網(wǎng)絡(luò)中越重要。接近中心性排名前5位：HTR2A、PTPN1、IGF1R、HSD11B2、碳酸酐酶2(CA2)；介數(shù)排名前5位依次為：CA2、HTR2A、PTPN1、IGF1R、HSD11B2。由此可見，本網(wǎng)絡(luò)中介數(shù)與接近中心性較大的靶點(diǎn)同時(shí)也是自由度大、平均最短路徑最小的靶點(diǎn)。綜合以上參數(shù)表明，HSD11B2、PTPN1、IGF1R、HTR2A、CA2等靶點(diǎn)可能是補(bǔ)腎降壓方治療高血壓的潛在靶點(diǎn)。

圖2 中藥靶標(biāo)-疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)網(wǎng)

表3 補(bǔ)腎降壓方治療高血壓的候選靶標(biāo)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

(續(xù)表)

2.3 補(bǔ)腎降壓方成分靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)-通路的構(gòu)建與分析 為進(jìn)一步明確核心關(guān)鍵靶標(biāo)的生物學(xué)功能，使用DAVID數(shù)據(jù)庫工具通過GO和KEGG針對(duì)補(bǔ)腎降壓方成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵核心節(jié)點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)及排名前20位的通路，得到關(guān)鍵核心靶標(biāo)參與的關(guān)鍵通路信息(見表4)?？梢钥闯鲈摬糠职袠?biāo)顯著富集于多條與高血壓相關(guān)的通路，包括：血壓調(diào)節(jié)(regulation of blood pressure)、鈣信號(hào)通路(calcium signaling pathway)、蛋白信號(hào)傳導(dǎo)(G-protein signaling，coupled to cyclic nucleotide second messenger)、醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收(aldosterone-regulated sodium reabsorption)、血管平滑肌收縮(vascular smooth muscle contraction)等。

表4 關(guān)鍵靶標(biāo)功能信息與通路信息

2.4 中藥-成分-靶標(biāo)-通路及潛在分子機(jī)制挖掘 構(gòu)建Cytoscape網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，來自補(bǔ)腎降壓方的8味中藥且都有貢獻(xiàn)的49個(gè)活性成分，其中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目最多(18個(gè))的為鄰苯二酚單乙酸鹽來自澤瀉；其次對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目17個(gè)的為棕櫚油酸甲酯來自地黃；對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目16個(gè)的有如下成分：β-谷固醇來自杜仲、山茱萸、三七；?；撬醽碜蕴炻?；單酚Alisol B與Alisol，B，23-乙酸鹽來自澤瀉；對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目14個(gè)的有如下成分：(-)-[(-)-煙堿單寧]來自杜仲，四氫精氨酸來自山茱萸，香豆酚C來自澤瀉；槲皮素來自杜仲、牡丹皮、三七、山楂，對(duì)應(yīng)9個(gè)重要靶點(diǎn)。山萘酚來自杜仲、牡丹皮、山楂，對(duì)應(yīng)7個(gè)重要靶點(diǎn)。靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)特征分析見表5。所預(yù)測(cè)補(bǔ)腎降壓方中有49個(gè)活性成分與腎上腺素受體(ADRA1B、ADRB1、ADRB2、ADRB3)、鈣電壓門控通道亞基(ca CACNA1C、CACNA1G)、腺苷受體(ADORA1、ADORA2A、ADORA2B)、多巴胺受體(DRD1、DRD2)、內(nèi)皮素受體(EDNRA、EDNRB)、一氧化氮合酶(NOS2、NOS3)、精氨酸加壓素受體1A(AVPR1A)、HTR2A、胰高血糖素受體(GCGR)、葡萄糖激酶(GCK)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、胰島素受體(INSR)、神經(jīng)肽Y受體Y1(NPY1R)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2β(PTK2B)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)等30個(gè)主要靶點(diǎn)有很強(qiáng)的相互作用。網(wǎng)絡(luò)富集分析顯示，通過血壓調(diào)節(jié)、鈣信號(hào)通路、血管平滑肌收縮、醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收等 15 條通路，調(diào)節(jié)鈣鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)、血管內(nèi)皮功能、糖脂代謝等參與血管舒張、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等。

圖3 關(guān)鍵靶標(biāo)的 KEGG 通路及GO功能富集分析

表5 補(bǔ)腎降壓方候選成分篩選

(續(xù)表)

3 討 論

高血壓的治療使血壓得到控制，腦卒中明顯減少，但對(duì)心血管死亡率影響較小[21]。這可能與未注意糾正與代謝紊亂有關(guān)的各種心血管危險(xiǎn)因素相關(guān)[22]。研究數(shù)據(jù)顯示，高血壓病人中血脂異常約占總病例數(shù)的69.5%，血糖異常約占55.3%[23]；中醫(yī)藥在治療高血壓前期、高血壓、肥胖性高血壓、難治性高血壓等方面積累了大量經(jīng)驗(yàn)，復(fù)方藥物既能改善臨床癥狀，也能穩(wěn)定血壓，平穩(wěn)降壓，保護(hù)靶器官，改善危險(xiǎn)因素，使部分病人達(dá)到停藥減量目的[24-25]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為高血壓分為“眩暈”和“頭痛”，補(bǔ)腎降壓方臨床應(yīng)用30余年，用于治療1級(jí)、2級(jí)原發(fā)性高血壓，臨床療效確切[26]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究補(bǔ)腎降壓方的降壓機(jī)制。

本研究應(yīng)用ADME分析篩選得到93種可被口服吸收的化學(xué)成分，其中杜仲13個(gè)、地黃10個(gè)、天麻23個(gè)、山茱萸16個(gè)、牡丹皮9個(gè)、澤瀉10個(gè)、三七7個(gè)、山楂5個(gè)?！爸嗅t(yī)藥-成分-目標(biāo)-路徑”網(wǎng)絡(luò)，來自補(bǔ)腎降壓方8味中藥且都有貢獻(xiàn)的49個(gè)活性成分，其中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目最多為鄰苯二酚C單乙酸鹽，來自澤瀉，其次為棕櫚油酸甲酯，來自地黃；再次為β-谷固醇，來自杜仲、山茱萸、三七，?；撬醽碜蕴炻?，單酚Asolol B與Alisol，B，23-乙酸鹽來自澤瀉；以及槲皮素、山萘酚、天麻素等，具有明顯抗高血壓相關(guān)作用。天麻素能通過PKA依賴性信號(hào)通路激活血管平滑肌中的ATP敏感性鉀通道(KATP)，引起血管舒張[27]，從而起到降壓作用[28]。山萘酚來自杜仲、牡丹皮、山楂，可內(nèi)皮依賴性舒張血管，并可抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)導(dǎo)致的血管重構(gòu)[29]；而來自杜仲、牡丹皮、三七、山楂的槲皮素為天然黃酮類降壓成分，今后的研究可重點(diǎn)進(jìn)行更多補(bǔ)腎降壓方抗高血壓作用的有效成分如山萘酚、天麻素等與槲皮素(源于杜仲、牡丹皮、三七、山楂)之間降血壓的協(xié)同藥效和機(jī)制研究。

網(wǎng)絡(luò)富集分析預(yù)測(cè)補(bǔ)腎降壓方中有49個(gè)活性成分與治療高血壓預(yù)測(cè)82個(gè)共有靶基因，并與腎上腺素受體、腺苷受體、多巴胺受體、內(nèi)皮素受體、一氧化氮合酶、精氨酸加壓素受體1A、HTR2A、胰高血糖素受體、葡萄糖激酶、血紅素加氧酶1、胰島素受體、神經(jīng)肽Y受體Y1、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2β、過氧化物酶體增殖物激活受體等30個(gè)主要靶點(diǎn)有很強(qiáng)的相互作用。所涉及≥10 個(gè)靶點(diǎn)共同富集的15條關(guān)鍵通路，參與高血壓病理過程的不同環(huán)節(jié)如調(diào)節(jié)鈣鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)、血管內(nèi)皮功能、糖脂代謝等。

值得一提的是，山萘酚與槲皮素對(duì)胰島素受體等與糖脂代謝相關(guān)的mRNA靶基因有作用。既往研究表明，槲皮素可促進(jìn)PI3K-Akt-eNOS通路激活，保護(hù)內(nèi)皮功能、改善胰島素抵抗[30-32]；而補(bǔ)腎降壓方前期研究已證實(shí)可上調(diào)血清脂聯(lián)素水平，增加胰島素敏感性，提示應(yīng)用補(bǔ)腎降壓方改善自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)胰島素抵抗機(jī)制可能與提高血清脂聯(lián)素水平有關(guān)，因此，本研究為進(jìn)一步探索其藥理機(jī)制指明方向并提供基礎(chǔ)。

4 小 結(jié)

本研究探討補(bǔ)腎降壓方在高血壓治療中的潛在“活性成分-靶點(diǎn)途徑”網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制，得到93種可被口服吸收的化學(xué)成分(杜仲13個(gè)、地黃10個(gè)、天麻23個(gè)、山茱萸16個(gè)、牡丹皮9個(gè)、澤瀉10個(gè)、三七7個(gè)、山楂5個(gè))。補(bǔ)腎降壓方主要通過參與高血壓病理過程的不同環(huán)節(jié)，如調(diào)節(jié)鈣鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)、血管內(nèi)皮功能、糖脂代謝等舒張血管、改善胰島素抵抗。然而，目前預(yù)測(cè)出的網(wǎng)絡(luò)模型得出的高血壓降壓機(jī)制還有待進(jìn)一步藥效學(xué)驗(yàn)證。本研究關(guān)于胰島素抵抗結(jié)果與實(shí)驗(yàn)研究基本一致，未來將進(jìn)一步結(jié)合課題組前期對(duì)補(bǔ)腎降壓顆粒高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)指紋圖譜分析，完善補(bǔ)腎降壓顆粒制劑的質(zhì)量控制。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)補(bǔ)腎降壓方降壓機(jī)制進(jìn)行研究，探尋補(bǔ)腎降壓方的有效成分、治療靶點(diǎn)及信號(hào)通路，對(duì)闡釋補(bǔ)腎降壓方的降壓機(jī)制具有一定參考意義。