楊柳 任興昌* 吳麗娟 楊文偉 舒暢 方敏

目前認(rèn)為大多數(shù)肺腺癌是通過(guò)肺泡上皮腺瘤樣不典型增生（AAH）發(fā)展成為微浸潤(rùn)腺癌，最終成為浸潤(rùn)性腺癌，因所處的時(shí)間階段不同，其細(xì)胞形態(tài)與相關(guān)組織結(jié)構(gòu)發(fā)生多樣性變化，在病理診斷工作中，經(jīng)?？梢杂^察到一些組織結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的現(xiàn)象與經(jīng)典的原位腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)存在一定差別，給臨床診斷帶來(lái)困惑［1］。除了疾病本身發(fā)展的多樣性，還包括手術(shù)中、制片過(guò)程中組織擠壓等，冰凍切片后肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，肺泡內(nèi)組織細(xì)胞增多等情況下，原位腺癌與貼壁型、腺泡型等，浸潤(rùn)性癌的形態(tài)重疊，難以準(zhǔn)確辨認(rèn)，需要借助免疫組化表達(dá)鑒別病變的性質(zhì)和范圍。本文探討CD34在肺腺癌中判斷是否有浸潤(rùn)性改變的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床材料 選擇2015年1月至2019年12月本院肺腺癌標(biāo)本患者100例，確診為原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），包括穿刺標(biāo)本9例及亞肺葉切除（肺段切除、楔形切除）91例。其中原位腺癌18例，微浸潤(rùn)性腺癌23例，貼壁為主型肺腺癌10例。其余均為浸潤(rùn)性肺腺癌，包含腺泡為主型腺癌21例，乳頭為主型腺癌9例，微乳頭為主型腺癌7例，實(shí)體為主型伴黏液產(chǎn)生腺癌12例。所有病理切片均采用蘇木精-伊紅（HE）染色，行免疫組化，包括CD34、CD31、F8、Ki67、P53、TTF-1、NapsinA。并回顧性分析病史，電話隨訪，復(fù)閱切片。

1.2 方法 收錄的樣本均使用濃度為10%福爾馬林完成固定，規(guī)范取材，常規(guī)脫水、透明、經(jīng)石蠟完成包埋，制成規(guī)格為4 μm厚連續(xù)切片并行HE染及免疫組化染色。免疫組化采用EnVision 兩步法，深達(dá)自動(dòng)免疫組化儀，選擇CD34、CD31、P53抗體和相關(guān)試劑盒為福州邁新公司出品；F8、Ki67、TTF-1、NapsinA為北京中杉公司出品。PH9.0一抗修復(fù)抗原，二抗購(gòu)于廈門通靈生物醫(yī)藥公司，采用葡萄串式多聚法生產(chǎn)的二抗檢測(cè)試劑，將陽(yáng)性切片及自身陽(yáng)性作為陽(yáng)性對(duì)照。使用PBS用于替代一抗視為陰性對(duì)照組。

1.3 判定方式 免疫組化切片由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師閱片審核。CD34以清晰棕黃色顆粒著色在肺泡壁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)均勻完整的勾勒出毛細(xì)血管網(wǎng)為完整表達(dá)，以毛細(xì)血管網(wǎng)缺乏連續(xù)性、消失為表達(dá)缺失；CD31為胞膜陽(yáng)性，TTF-1、P53、Ki-67為核著色，天冬氨酸蛋白酶Napsin-A、F8陽(yáng)性部位為胞質(zhì)。

1.4 觀察指標(biāo) 免疫組化標(biāo)記物CD34、CD31、F8、TTF-1、Napsin-A、ki-67、P53在肺腺癌中的表達(dá)情況、患者年齡、性別、吸煙史、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、是否復(fù)發(fā)、死亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常用血管內(nèi)皮相關(guān)標(biāo)記物對(duì)肺泡壁結(jié)構(gòu)的顯示情況及TTF-1、NapsinA對(duì)肺腺癌的免疫組化表達(dá)情況CD31、F8均不能勾勒出肺泡壁的結(jié)構(gòu)；CD34于非腫瘤性肺泡及貼壁生長(zhǎng)的原位腺癌區(qū)均能較好顯示肺泡壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1）。原位腺癌及貼壁生長(zhǎng)的腺癌中，腫瘤上皮細(xì)胞伴行肺泡壁結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)棕黃色均勻完整的表達(dá)肺泡壁毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)，連續(xù)性好，清晰可見(jiàn)，在有組織細(xì)胞充填肺泡腔或肺泡纖維增厚顯著的區(qū)域仍能容易判別肺泡壁結(jié)構(gòu)的完整性；而在微浸潤(rùn)及浸潤(rùn)性癌中CD34呈現(xiàn)的肺泡壁毛細(xì)血管網(wǎng)不同程度表達(dá)消失，混亂，缺乏連續(xù)性，肺泡壁被腫瘤相關(guān)纖維組織增生破壞，血管少而稀疏（見(jiàn)圖2、3）。兩者CD34間質(zhì)表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。腺癌組織TTF-1與NapsinA總體表達(dá)率分別為100%和97.5%。

2.2 各類型肺腺癌中CD34、P53、Ki67的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 CD34所標(biāo)記診斷的早期腺癌及微浸潤(rùn)性腺癌的平均年齡低于浸潤(rùn)性腺癌（P<0.05）。腺癌總體性別女性大于男性（63% vs 37%）。浸潤(rùn)性癌吸煙率高于早期腺癌。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、脈管癌栓，復(fù)發(fā)率和死亡率比較，浸潤(rùn)性腺癌明顯高于早期腺癌（P<0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 A． 原位癌，HE染色（×10．0）。B． CD34標(biāo)記肺泡壁毛細(xì)血管網(wǎng)完整，癌細(xì)胞局限在肺泡壁內(nèi)。C． CD31血管及組織細(xì)胞陽(yáng)性（×10．0）。D． F8（×10．0）

圖2 A． HE染色 原位癌（×3．0）。B． CD34標(biāo)記完整肺泡結(jié)構(gòu)，證實(shí)癌細(xì)胞局限在肺泡壁內(nèi)。C． HE染色 微浸潤(rùn)性癌（×3．0）。D． CD34在原位癌1區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)呈陽(yáng)性表達(dá)，在微浸潤(rùn)性2區(qū)域表達(dá)缺失。E． HE染色 浸潤(rùn)性癌（×3．0）。F． 浸潤(rùn)性癌CD34肺泡結(jié)構(gòu)中斷，缺失

圖3 A． 乳頭為主型腺癌，HE染色（×3．0）；B． 對(duì)照乳頭為主型腺癌CD34標(biāo)記的毛細(xì)血管網(wǎng)大部分中斷、消失（×3．0）；C． 實(shí)性為主型伴黏液產(chǎn)生微浸潤(rùn)性癌，HE染色（×10．0）；D．對(duì)照實(shí)性為主型伴黏液產(chǎn)生微浸潤(rùn)性癌CD34標(biāo)記的毛細(xì)血管網(wǎng)絕大部分消失（×10．0）；E． 腺泡為主型腺癌（×10．0），HE染色；F． 對(duì)照腺泡為主腺癌CD34標(biāo)記的肺泡結(jié)構(gòu)大部分消失。G． 微乳頭為主型腺癌，HE染色（×3．0）；G． 對(duì)照微乳頭為主的腺癌CD34標(biāo)記的毛細(xì)血管網(wǎng)部分中斷，消失（×3．0）

表1 各類型肺腺癌中CD34、P53、Ki67的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（%）

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)肺癌發(fā)生概率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。較多國(guó)家，腺癌已超過(guò)鱗狀細(xì)胞癌成為最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型［2］。根據(jù)肺癌患者所處的腫瘤分期差異，與患者病情及身體耐受情況所選的治療方案有所不同，如化療、手術(shù)、放療及聯(lián)合放化療等，而患者的生存期也不同。大多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)病患時(shí)已為晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，預(yù)后差，死亡率高，而據(jù)統(tǒng)計(jì)原位腺癌和微浸潤(rùn)腺癌，患者手術(shù)后5年生存率為100%，手術(shù)切除范圍小，患者生活質(zhì)量高［3］。因此，肺癌早期診斷及系統(tǒng)化治療方案對(duì)肺癌的治療起重要效果。其能夠增加肺癌患者的生存時(shí)間［4］。

從肺泡上皮腺瘤樣不典型增生（AAH）發(fā)展成為微浸潤(rùn)腺癌，進(jìn)而成為浸潤(rùn)性腺癌的演變過(guò)程中，因原位腺癌發(fā)生時(shí)間長(zhǎng)短不一，不同區(qū)域腫瘤形態(tài)有明顯差異，某些原位癌區(qū)域生長(zhǎng)活躍，某些原位癌區(qū)域肺泡萎縮脫落，周圍肺間質(zhì)纖維組織增生，而造成原有肺泡組織結(jié)構(gòu)多形，而形成的假浸潤(rùn)與腫瘤細(xì)胞推擠肺泡壁，使肺泡萎縮、塌陷進(jìn)而腫瘤取代肺間隔纖維瘢痕的真浸潤(rùn)相鑒別［1］。雖然世界衛(wèi)生組織與國(guó)際多學(xué)科肺腺癌分類已經(jīng)對(duì)肺腺癌制定了完整的分類標(biāo)準(zhǔn)，但在臨床工作中原位癌與微浸潤(rùn)性腺癌、及前者與腺泡為主型腺癌的鑒別診斷經(jīng)常會(huì)受到阻礙，尤其是與腺泡為主型的肺腺癌的鑒別困難，有時(shí)形態(tài)學(xué)難以具體體現(xiàn)或在制片過(guò)程中組織受到擠壓，及冰凍切片后剩余組織中，原位腺癌與浸潤(rùn)性癌的形態(tài)重疊也會(huì)給病理醫(yī)師產(chǎn)生困惑。這時(shí)免疫組化指標(biāo)CD34的染色結(jié)果，可以為評(píng)估肺泡結(jié)構(gòu)提供額外的幫助。

CD34屬于血管內(nèi)皮標(biāo)志物。因在發(fā)育及成熟的個(gè)體中，一切血管內(nèi)皮細(xì)胞均體現(xiàn)出CD34高表達(dá)狀態(tài)。因此，CD34通常被用于血管內(nèi)皮細(xì)胞典型標(biāo)志物。經(jīng)免疫組化染色顯現(xiàn)血管內(nèi)皮，能夠全面體現(xiàn)出肺腺癌腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)情況與腫瘤生物學(xué)特點(diǎn)，但在臨床病理診斷過(guò)程中，要排除肺纖維化等其他非腫瘤性導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)破壞的情況。而同樣作為血管內(nèi)皮免疫組化標(biāo)記物，CD31曾被認(rèn)為是一種最為敏感的血管內(nèi)皮標(biāo)志物，但其在造血組織如血小板、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞中也可以表達(dá)［5］，尤其在出血區(qū)域易著色，背景臟亂，及肺泡巨噬細(xì)胞豐富的病例時(shí)，CD31的染色結(jié)果可能會(huì)使人困惑［6］。F8是一種最早被運(yùn)用到臨床的血管內(nèi)皮標(biāo)志物［7］，可以顯現(xiàn)大、小血管，在血管腫瘤中其陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)95%［8］，但不能完整表達(dá)肺泡壁結(jié)構(gòu)，尤其在組織擠壓變形更不易辨認(rèn)。經(jīng)臨床病理工作中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)8與CD31均不能較好顯示肺泡間隔氣體交換的毛細(xì)血管網(wǎng)，不能判斷肺泡壁結(jié)構(gòu)存在與否。多種器官基底型上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK5/6和p63在外周氣道上皮均有表達(dá)，但不表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞［9］。

研究證明，CD34通過(guò)顯示肺泡壁毛細(xì)血管網(wǎng)完整或消失幫助判別肺腺癌是否有浸潤(rùn)是有臨床意義的。病理醫(yī)師遇到原位癌與腺泡型腺癌診斷困難，通過(guò)CD34診斷21例，原位癌與微浸潤(rùn)性腺癌診斷困難14例，其他病例HE染色與CD34的免疫組化表達(dá)診斷一致。在表達(dá)為浸潤(rùn)性腺癌的病例中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、復(fù)發(fā)率與死亡率明顯高于早期腺癌（P<0.05）。TTF-1蛋白陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞核，Napsin-A陽(yáng)性定位于胞質(zhì)，在腺癌組織總體陽(yáng)性率表達(dá)分別為100%和97.5%。Ki-67在浸潤(rùn)性腺癌的陽(yáng)性率明顯比早期腺癌的范圍高，P53在浸潤(rùn)性腺癌的突變率比在腺癌的范圍高（P<0.01）。表明CD34在判斷肺腺癌是否有浸潤(rùn)的臨床意義的準(zhǔn)確性。綜上所述，隨著新版肺腺癌的推廣，長(zhǎng)期的臨床實(shí)驗(yàn)表明，免疫組化標(biāo)記CD34在臨床早期肺癌與浸潤(rùn)性肺癌的鑒別診斷起到了重要的作用，成為臨床早期肺癌有效的輔助診斷。