范佳俊 陳烽 高威 陳哲*

310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（陳哲）

骨碎補(bǔ)為槲蕨科槲蕨屬植物的干燥根莖，味苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛、活血散瘀的功效。自古在中醫(yī)廣泛用于治療跌撲閃挫、筋骨折傷、骨質(zhì)缺損、牙齒松動(dòng)等癥。骨骼作為動(dòng)態(tài)的活性組織，通過持續(xù)舊骨吸收和新骨形成修復(fù)損傷、維持自身完整的生理結(jié)構(gòu)及骨量平衡的過程稱為骨重建?，F(xiàn)代中醫(yī)研究及西醫(yī)臨床研究已經(jīng)證明骨碎補(bǔ)在骨質(zhì)疏松及骨折愈合中促骨形成的骨重建作用。柚皮苷是骨碎補(bǔ)的主要活性成分［1］，是經(jīng)提煉、純化得到的一種單體物質(zhì)。其傳承骨碎補(bǔ)的藥用價(jià)值，在西醫(yī)基礎(chǔ)研究中展現(xiàn)出在骨缺損修復(fù)重建方面的潛力。

1 中醫(yī)研究現(xiàn)狀

從《黃帝內(nèi)經(jīng)》的“腎主骨”之說，到《素問》指出的“腎之和骨也，主骨生髓，在體為骨。腎者，精之所處，其充在骨”。中醫(yī)學(xué)歷來認(rèn)為“腎藏精，主骨生髓，滋養(yǎng)骨骼，骨的生成需要腎氣推動(dòng)、腎精滋養(yǎng)”。骨碎補(bǔ)屬于補(bǔ)腎強(qiáng)骨、益精補(bǔ)髓的中藥，《本草新編》曰“入骨，用之以補(bǔ)接傷碎最神”。馬曉飛等［2］對97例患者應(yīng)用以骨碎補(bǔ)為君藥的活血益骨湯進(jìn)行脊柱骨折術(shù)后促骨折愈合的治療，實(shí)驗(yàn)組患者在緩解術(shù)后骨折部位疼痛及骨折愈合方面的有效率較對照組提高15%。王寶峰［3］對93例患者應(yīng)用以骨碎補(bǔ)為君藥的健骨益腎方，對脊柱骨折行手術(shù)加藥物的聯(lián)合治療，健骨益腎方可顯著提升患者血清骨鈣素、堿性磷酸酶水平，改善視覺模擬評分（VAS）及Oswestry功能障礙指數(shù)（ODI評分），促進(jìn)骨折愈合。關(guān)一等［4］報(bào)道椎弓根螺釘內(nèi)固定聯(lián)合加味復(fù)元活血湯治療胸腰椎骨折，患者住院時(shí)間更少、骨折愈合時(shí)間明顯縮短，術(shù)后隨訪顯示遠(yuǎn)期療效可靠、持久、安全。陳勍等［5］使用強(qiáng)骨飲對120例股骨粗隆間骨折術(shù)后患者進(jìn)行骨重建治療，隨訪顯示實(shí)驗(yàn)組患者對側(cè)股骨粗隆再發(fā)骨折發(fā)生率明顯下降，有效降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。

骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)屬“骨痿”范疇。《臨證指南醫(yī)案·瘺》指出：“腎藏精，精生血，血虛則筋骨失養(yǎng)”。腎精虧損，則骨骼失其所養(yǎng)，髓虛而骨枯，然發(fā)骨病，發(fā)為骨痿?！端貑枴ゐ粽撈吩疲骸澳I氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”。“腎者，水臟也。金水不能勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥主要與腎臟的盛衰有關(guān)。多因腎虛、氣血瘀滯導(dǎo)致，腎虛為發(fā)病之本，血瘀為發(fā)病之標(biāo)，可以采用“補(bǔ)腎填精”的方法治療骨質(zhì)疏松患者。段曉棟［6］應(yīng)用益腎壯骨湯，方中以骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎活血、止痛續(xù)傷為君藥，對患者行抗骨質(zhì)疏松治療，治療后患者骨密度明顯提升。強(qiáng)骨飲方中以骨碎補(bǔ)主補(bǔ)腎強(qiáng)骨，輔以其他藥物活血通絡(luò)、補(bǔ)益氣血，應(yīng)用于抗骨質(zhì)疏松治療中，有降低骨吸收率［7］、改善骨密度、緩解骨質(zhì)疏松性疼痛等作用［8］。

2 西醫(yī)研究現(xiàn)狀

2.1 西醫(yī)臨床研究 骨折是常見的骨科疾病，骨折延遲愈合、骨不連是其嚴(yán)重并發(fā)癥［9］。MILLS等［10］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，每年每1000例人口中會(huì)有23.2例發(fā)生骨折事件，骨折后發(fā)生不愈合風(fēng)險(xiǎn)為1.9%。骨不連發(fā)生率及數(shù)量在不同年齡、性別及骨折部位間存在明顯差異，有向年輕化發(fā)展的不良趨勢。葉靈超等［11］對108例骨折延遲愈合患者行骨碎補(bǔ)注射液肌注治療，實(shí)驗(yàn)組患者血清中堿性磷酸酶、神經(jīng)生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2水平治療后顯著提升，與對照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)骨折延遲愈合患者的治療有效率也顯著提升。

骨質(zhì)疏松癥常發(fā)生于中老年人，特點(diǎn)是骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨密度和質(zhì)量下降，骨脆性增加。骨碎補(bǔ)在西醫(yī)臨床上已被制作成成品藥物強(qiáng)骨膠囊廣泛使用。秦礎(chǔ)強(qiáng)等［12］使用強(qiáng)骨膠囊治療慢性阻塞性肺疾病合并骨質(zhì)疏松癥患者，治療后患者L1～4椎體及左側(cè)股骨頸骨密度得到提升，軀體疼痛VAS評分及ODI評分明顯改善。調(diào)查研究顯示［13］，我國中老年人骨質(zhì)疏松癥總體患病率約23%，其中男性患病率約16%，女性在絕經(jīng)后骨質(zhì)流失率是男性的2～10倍［14］，患病率約27%。長期骨質(zhì)疏松且不加以骨重建干預(yù)，最終會(huì)引起骨質(zhì)疏松性骨折，尤其是髖部骨折和椎骨骨折，是導(dǎo)致老年人殘疾、死亡的重要原因［15］。在治療骨質(zhì)疏松性椎體骨折患者的策略上，經(jīng)皮椎體成形術(shù)（PVP）被認(rèn)為是一種見效快、風(fēng)險(xiǎn)小、患者滿意度高的微創(chuàng)手段［16］。但從遠(yuǎn)期療效考慮，抗骨質(zhì)疏松治療是更為重要的后續(xù)保障。謝占成［17］對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折PVP術(shù)后患者使用強(qiáng)骨膠囊進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松治療，治療6個(gè)月后患者髖部及腰椎骨密度明顯提升，血清鈣、磷含量下降，堿性磷酸酶水平上升，PVP術(shù)后患者軀體疼痛癥狀進(jìn)一步獲得改善。老年患者長期使用骨碎補(bǔ)并未出現(xiàn)肝、腎功能異常，同時(shí)藥物不良反應(yīng)發(fā)生率低，表現(xiàn)出強(qiáng)骨膠囊優(yōu)異的安全性。此外，薈萃分析顯示強(qiáng)骨膠囊擁有不亞于常規(guī)藥物如：活性維生素D3、阿侖磷酸鈉、鈣爾奇D、雌激素、骨化三醇膠丸等抗骨質(zhì)疏松療效，且安全性更佳［18］。

2.2 西醫(yī)基礎(chǔ)研究 （1）柚皮苷對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作用：柚皮苷是骨碎補(bǔ)的主要活性成分，是經(jīng)提煉、純化后得到的一種單體物質(zhì)。柚皮苷可以通過促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化參與骨形成，抑制破骨細(xì)胞活性并減少骨吸收［19］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是存在于骨髓基質(zhì)中具有分化為成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞亞群的干細(xì)胞。BMSCs在體內(nèi)增殖并分化形成骨骼的能力使其成為再生醫(yī)學(xué)中重建骨骼的一種極具研究潛力的細(xì)胞［20］?，F(xiàn)階段對于BMSCs的研究主要細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，1～100 μg/ml的柚皮苷溶液干預(yù)能增強(qiáng)人BMSCs的增殖，通過激活ERK信號(hào)通路，促進(jìn)成骨相關(guān)標(biāo)志物（ALP、Runx2、Osterix、骨鈣素和I型膠原蛋白）表達(dá)［21］，促進(jìn)BMSCs成骨分化，加速礦物質(zhì)積累，誘導(dǎo)鈣結(jié)節(jié)形成，濃度>200 μg/ml可能會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用［22］。對于不同來源的BMSCs，柚皮苷的效應(yīng)濃度也不盡相同。在大鼠BMSCs中，最佳濃度為10-5～10-6mol/L［23］，柚皮苷上調(diào)β-catenin、LRP5、Runx2及Osterix等相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)成骨分化［24］。MAPK、ERK、Notch、IHH以及JNK信號(hào)通路等也可能參與其中［25］。在兔BMSCs中柚皮苷效應(yīng)濃度<10-4mol/L［26］，在犬BMSCs中為10-6～10-7mol/L［27］，均促進(jìn)BMSCs成骨分化和鈣鹽沉積，還有學(xué)者認(rèn)為柚皮苷的有效作用濃度在10-9～10-4mol/L［28］。（2）柚皮苷對成骨細(xì)胞作用：成骨細(xì)胞是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來。成熟后的成骨細(xì)胞呈單層排列覆蓋于骨表面，分泌骨膠原，合成骨基質(zhì)，釋放鈣離子使骨組織鈣化，直接影響著骨的形成和重建。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，柚皮苷作用下培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞，測量顯示堿性磷酸酶活性增高，成骨細(xì)胞數(shù)量增多，骨鈣素、骨橋蛋白分泌增多，茜素紅染色可見鈣化結(jié)節(jié)形成［29］。徐高麗等［30］發(fā)現(xiàn)柚皮苷在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的同時(shí)，也增強(qiáng)其分泌I型膠原蛋白。有研究認(rèn)為，這可能與柚皮苷激活PI3K/Akt、ERK1/2信號(hào)通路，縮短成骨細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期時(shí)間，同時(shí)使處于S期的細(xì)胞比例增高，處于凋亡期的比例下降［31］。翟遠(yuǎn)坤等［32］認(rèn)為柚皮苷也通過雌激素信號(hào)通路，促進(jìn)成骨相關(guān)因子如：堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、Runx2、Osterix和雌激素受體（ER）ERα及βmRNA的表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞促骨形成作用。KUANG等［33］研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷在激活A(yù)kt信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞增殖同時(shí)，還可以抑制Bad信號(hào)通路抑制骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞生成。AMPK信號(hào)通路亦可能與之有關(guān)［34］。柚皮苷對成骨細(xì)胞的作用同樣存在濃度依賴性，濃度范圍從10～1000 μmmol/L，對成骨細(xì)胞增殖作用先增強(qiáng)后減弱，100 μmmol/L是最佳作用濃度也被眾多研究認(rèn)同和采用［30］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，袁毅等［35］應(yīng)用柚皮苷治療大鼠股骨骨折，Micro-CT結(jié)果顯示骨折斷端由近到遠(yuǎn)5 mm范圍內(nèi)骨礦物質(zhì)含量、骨體積分?jǐn)?shù)明顯增高，DR片檢查顯示柚皮苷組大鼠股骨骨折線消失更早，斷端骨痂生長速度更快，骨愈合所需時(shí)間明顯縮短。孫道喜［36］用不同濃度柚皮苷治療骨質(zhì)疏松性骨折大鼠發(fā)現(xiàn)，1～100 mg/kg柚皮苷呈劑量依賴性促進(jìn)骨折區(qū)成骨細(xì)胞增殖、分化，加速原始骨小梁向成熟骨小梁改建，最大程度恢復(fù)骨質(zhì)疏松性骨折骨痂的最大載荷。WANG等［37］用柚皮苷治療去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠，測量小鼠股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和腰1椎體三處骨密度均顯示小鼠骨密度明顯改善，阻斷小鼠骨骼生物力學(xué)骨強(qiáng)度的下降。黃俊波等［38］用柚皮苷治療兔雙側(cè)股骨髁間窩骨軟骨缺損，治療6個(gè)月后可見新生軟骨完全覆蓋缺損并與周圍正常軟骨組織產(chǎn)生融合，缺損處組織中II型膠原蛋白表達(dá)量明顯增高。張鏑等［39］研究亦證實(shí)柚皮苷能促進(jìn)大鼠股骨干骨缺損的修復(fù)重建。（3）柚皮苷對破骨細(xì)胞作用：破骨細(xì)胞在人體主要發(fā)揮骨吸收功能，與成骨細(xì)胞功能相對應(yīng)。破骨細(xì)胞的活性決定骨的凈流失量。RANK/RANKL/OPG軸是調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的重要信號(hào)通路，對破骨細(xì)胞的影響尤為重要。RANK表達(dá)于破骨細(xì)胞表面，RANKL與之結(jié)合可以觸發(fā)TRAF6，隨后激活下游NF-κB和MAPKs信號(hào)通路，改變c-fos、NFATc1和c-Jun的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞的分化與形成［40］。OPG可通過占位效應(yīng)阻止RANKL與RANK結(jié)合，防止骨的過度吸收。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，由RANKL誘導(dǎo)單核細(xì)胞（RAW264.7）分化為成熟破骨細(xì)胞的過程中，柚皮苷通過下調(diào)RANK、TRAP、NFATc1的表達(dá)，上調(diào)c-fos的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞增殖、分化及骨吸收功能，使破骨細(xì)胞在薄骨片上的骨吸收陷窩數(shù)及吸收總面積大幅下降［41］。ANG等［42］報(bào)道，柚皮苷還可以抑制RANKL誘導(dǎo)的NF-κB和ERK的活化，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收功能。且破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞也存在微妙的關(guān)系，當(dāng)破骨細(xì)胞分泌的RANK與成骨細(xì)胞表面RANKL相結(jié)合，可以觸發(fā)RANKL反向信號(hào)傳導(dǎo)激活Runx2，從而激活成骨細(xì)胞功能促進(jìn)骨形成［43］。XU等［44］發(fā)現(xiàn)在100 mg/L的濃度下柚皮苷可以發(fā)揮最佳效應(yīng)，通過上調(diào)OPG表達(dá)，使OPG/RANKL比例增加，從而抑制破骨細(xì)胞增殖及分化。同時(shí)，成骨細(xì)胞分泌的OPG也可以反作用于破骨細(xì)胞，抑制其骨吸收功能。此外，柚皮苷還通過激活線粒體凋亡途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡［45］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，李念虎等［46］研究報(bào)道，全關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨組織與內(nèi)植物之間產(chǎn)生的磨屑會(huì)引起假體周圍骨溶解及骨丟失，最終導(dǎo)致內(nèi)植物松動(dòng)關(guān)節(jié)置換失敗。采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）顆粒模擬碎屑，誘發(fā)小鼠模型中破骨細(xì)胞性骨溶解，并使用150 mg/kg劑量柚皮苷治療。柚皮苷治療組明顯降低模型中TRAP（+）破骨細(xì)胞數(shù)量，減少1.5倍的鈣釋放及22%的骨膠原丟失。徐展望等［47］也采用柚皮苷治療PMMA顆粒誘發(fā)的小鼠膝釘模型的骨吸收，發(fā)現(xiàn)柚皮苷治療組脛骨近端植入釘周圍單位體積內(nèi)骨量是對照組的3倍，拔出植入釘?shù)钠骄缑婕袅Ψ迨菍φ战M的2.5倍。（4）柚皮苷與生物材料的結(jié)合應(yīng)用： 柚皮苷在臨床中應(yīng)用不僅僅是其本身的單獨(dú)應(yīng)用，還有以各種支架材料作為載體的結(jié)合應(yīng)用。LAI等［48］設(shè)計(jì)制造的具有生物活性的鈦基生物材料TiO2納米管可以做到可控的緩釋柚皮苷，使柚皮苷對局部促骨形成作用保持在一個(gè)最佳濃度范圍及持久的作用時(shí)間。CHEN等［49］發(fā)現(xiàn)由明膠、β-磷酸三鈣、磷酸和柚皮苷組成的GGTN復(fù)合材料在骨移植中展現(xiàn)出較好的骨缺損修復(fù)能力，兔顱骨缺損區(qū)有大量新骨長入。WONG等［50］發(fā)現(xiàn)柚皮苷聯(lián)合膠原蛋白基質(zhì)作兔顱骨缺損骨移植，其移植后骨形成效果優(yōu)于自體骨及單純膠原蛋白基質(zhì)。

3 展望

不管是在中醫(yī)臨床上作為君藥配伍其他藥材組合為湯劑，還是西醫(yī)臨床上的成品藥物強(qiáng)骨膠囊，骨碎補(bǔ)已被廣泛應(yīng)用并展現(xiàn)其抗骨質(zhì)疏松和促骨折愈合的骨重建作用。骨碎補(bǔ)在骨重建過程中發(fā)揮著促骨形成，抑制骨吸收的總體效應(yīng)。鑒于骨碎補(bǔ)在基礎(chǔ)研究中被發(fā)掘出來的骨缺損修復(fù)重建的潛力，以后可能應(yīng)用于大段骨缺損修復(fù)?，F(xiàn)有研究中，作為復(fù)合材料的膠原蛋白基質(zhì)降解過快，無法匹配新生骨爬行替代的速率；GGTN可能存在生物相容性問題；TiO2納米管由于鈦的天然生物惰性，實(shí)現(xiàn)早期骨整合是其缺陷。因此，為了更好發(fā)揮骨碎補(bǔ)的骨重建特性，兼具生物相容性、植入安全性及合適降解速率的生物材料支架將是下一步研究的重點(diǎn)。