包黎莎 王華芳 楊錦熒 王春雷 單樂天*

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一類軟骨丟失、破壞、關(guān)節(jié)四周骨質(zhì)增生為特征的與年齡相關(guān)的慢性疾病，可同時(shí)累及滑膜、軟骨下骨和關(guān)節(jié)周圍軟組織，常見臨床表現(xiàn)為膝骨關(guān)節(jié)腫脹感，僵硬不適，進(jìn)展性膝關(guān)節(jié)疼痛，最終關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，甚至失用［1］。膝骨關(guān)節(jié)炎總患病率15%，隨年齡的增長(zhǎng)呈明顯遞增趨勢(shì)［2-3］。中醫(yī)將OA歸屬“骨痹”“痛痹”等范疇，中醫(yī)病機(jī)為肝腎虧虛加之外邪侵襲，造成風(fēng)寒濕熱和瘀血痹阻?！侗静菥V目》記載人參具有治療痹癥的作用，因其療效廣泛副作用低［4-5］，是經(jīng)典強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥物。人參總皂苷（TSPG）是人參中最重要的藥理成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物活性［6］。本文探討人參總皂苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)疼痛和軟骨修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SPF級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)方案通過醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器及試劑 人參總皂苷；碘乙酸（MIA，Sigma公司，批號(hào)：BCBL3682V）；戊巴比妥鈉，EDTA脫鈣液（Solarbio）；YLS-3E電子壓痛儀（安合盟天津科技發(fā)展有限公司）；37370足底熱輻射測(cè)痛（UGOBASILE）。

1.3 方法 （1）人參總皂苷溶液的配制：取人參總皂苷（TSPG）成品試劑（上海源葉生物有限公司），溶于超純水，分別配置成125 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml的溶液。（2）大鼠分組、造模及藥物干預(yù)：取SPF級(jí)雌性SD大鼠50只，隨機(jī)分為人參總皂苷高濃度組（TSPG-H 500 μg/ml）、人參總皂苷中濃度組（TSPG-M 250 μg/ml）、人參總皂苷低濃度組（TSPG-L 125 μg/ml）、模型組（Model組）和空白對(duì)照組（NC組），每組各10只?？瞻捉M大鼠通過微量注射器向其雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)各注射50 μl生理鹽水，其余四組大鼠各注射25 μg/ml碘乙酸50 μl進(jìn)行造模處理。造模后第7天測(cè)定大鼠壓痛閾值和熱痛閾值，與初始?jí)和撮撝?、熱痛閾值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后，開始藥物干預(yù)。TSPG-H組、TSPG-M組、TSPG-L組分別關(guān)節(jié)腔注射500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml人參總皂苷水溶液，模型組和空白對(duì)照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)注射等量生理鹽水，1次/周，共4周。（3）大鼠壓痛閾值測(cè)定：于造模后每周用YLS-3E電子壓痛儀測(cè)定各組大鼠的壓痛閾值。測(cè)定時(shí)，將大鼠前肢和上半身以適宜力道固定，使其處于舒適且被固定的狀態(tài)，將壓痛儀的扁形頭在大鼠雙側(cè)后足足背拇趾根平齊處施壓，壓力逐漸增大，當(dāng)大鼠出現(xiàn)明顯掙扎或鳴叫時(shí)，顯示的壓力值即為其壓痛閾值。（4）大鼠熱痛閾值測(cè)定：造模后每周采用足底熱輻射測(cè)痛儀測(cè)定各組大鼠雙側(cè)后足趾熱痛閾值。測(cè)定時(shí)將大鼠置于透明且大小合適的箱內(nèi)（恰好容納大鼠且其不可大范圍活動(dòng)）。測(cè)定前等待大鼠停止梳理毛發(fā)和探索性活動(dòng)，保持安靜（期間要注意保持大鼠足底干燥）。將測(cè)試儀置于玻璃板下，將儀器上的“十”字形標(biāo)對(duì)準(zhǔn)大鼠后足底中央（避開足墊）。開啟儀器，從開始加熱至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間即為大鼠熱痛閾值。每只大鼠測(cè)定3次，間隔5～6 min/次，取平均值作為測(cè)量值。（5）大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察：藥物干預(yù)完成后，處死所有大鼠，取其雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，置于4%多聚甲醛中固定72 h，流水徹底沖洗。隨后加入EDTA脫鈣液對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行脫鈣，每天更換脫鈣液體并觀察脫鈣程度。脫鈣完成后，常規(guī)操作脫水、包埋、切片，進(jìn)行HE染色，封片。光鏡下觀察軟骨組織病理學(xué)改變。并參照OARSI關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行積分統(tǒng)計(jì)（見表1）。OARSI評(píng)分越高，提示骨關(guān)節(jié)病變?cè)絿?yán)重。（6）軟骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：①軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)：采用膠原酶消化法提取。取新生大鼠5只，脫頸處死后，剃去毛發(fā)，于75%酒精中浸泡5 min徹底消毒大鼠體表。無菌操作取大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，剃除膝關(guān)節(jié)表面肌肉組織（操作時(shí)應(yīng)避免暴露關(guān)節(jié)腔），取出的膝關(guān)節(jié)在75%酒精中浸泡5 min后用手術(shù)刀打開關(guān)節(jié)腔，取出軟骨組織，以PBS緩沖液漂洗以充分洗去軟骨組織中殘留的結(jié)締組織。隨后將軟骨剪成小碎片，大小約為1 mm3，再次置于PBS緩沖液中漂洗3次后，棄去PBS，加入0.2% Ⅱ型膠原酶3 ml。振蕩搖勻使組織塊與Ⅱ型膠原酶充分接觸，放入37℃恒溫震蕩箱中消化40 min，取上層消化液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速800 r/min，離心5 min，棄上清液，取沉淀物（即細(xì)胞），加入4 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打、混勻，得到軟骨細(xì)胞懸液。所得懸液用濾網(wǎng)過濾并計(jì)數(shù)，調(diào)整懸液密度為2×105/ml接種于25 cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2，培養(yǎng)24 h后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁情況。②軟骨細(xì)胞CCK實(shí)驗(yàn)：取原代軟骨細(xì)胞，以每孔100 μl細(xì)胞懸液接種至96孔板中，即每孔5×103個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中，在37℃，5% CO2環(huán)境中預(yù)培養(yǎng)24 h；移除96孔板中IMDM培養(yǎng)液，隨機(jī)分為正常組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，正常組加入IMDM培養(yǎng)液，模型組每孔加入MIA（0.75 ng/ml）100 μl，實(shí)驗(yàn)組每孔加入MIA后，再分別加入低、中、高不同濃度人參總皂苷水溶液100 μl（125，250，500 μg/ml），置培養(yǎng)箱中孵育；48 h后，每孔加入10 μl CCK溶液，置培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定孔內(nèi)懸液在450 nm處的吸光度（A450），根據(jù)公式得出細(xì)胞活力，以檢測(cè)不同濃度的人參總皂苷水溶液對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響，重復(fù)測(cè)量3次。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式為：細(xì)胞增值率（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均A450值-正常組平均A450值）/（模型組平均A450值-正常組平均A450值）×100%。

表 1 OARSI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism7軟件。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參總皂苷對(duì)大鼠足部壓痛閾值的影響 造模4周后模型組與正常組比較壓痛閾值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明碘乙酸造模成功；TSPG-L組、TSPG-M組、TSPG-H組與模型組比較，壓痛閾值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且改善情況與TSPG濃度呈正相關(guān)，但仍低于正常組，見圖1。

2.2 人參總皂苷對(duì)大鼠足部熱痛閾值的影響 造模4周后模型組與正常組相比較熱痛閾值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；TSPG-L、TSPG-M、TSPG-H三組與模型組相比較，痛閾值均顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

2.3 大鼠膝關(guān)節(jié)組織學(xué)病理切片結(jié)果 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面明顯缺損，軟骨基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞丟失，為典型OA退變表現(xiàn)。TSPG組軟骨相較于模型組均有恢復(fù)，軟骨表面相對(duì)較完整，完整度為TSPG-H>TSPGM>TSPG-L，軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)接近正常水平，有肥大軟骨細(xì)胞少量，見圖3。與正常組比較，模型組OARSI評(píng)分明顯增高（P<0.01），TSPG治療組OARSI評(píng)分與模型組比較明顯降低（P<0.01），見圖4。

圖1 人參總皂苷水溶液對(duì)大鼠足部壓痛的影響

圖2 人參總皂苷水溶液對(duì)大鼠足部熱痛影響

圖3 各組大鼠軟骨組織病理切片（HE染色×100）

2.4 軟骨細(xì)胞CCK實(shí)驗(yàn)結(jié)果 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，與對(duì)照組比較，TSPG組軟骨細(xì)胞活力均增高（P<0.05），濃度為200 μg/ml組的軟骨細(xì)胞活力最高。見圖5。

圖5 人參總皂苷水溶液對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響

3 討論

OA是指以軟骨丟失及伴有關(guān)節(jié)周圍骨反應(yīng)為特點(diǎn)的一種滑膜關(guān)節(jié)病，其中以膝骨關(guān)節(jié)炎最常見。由多因素共同作用產(chǎn)生，如創(chuàng)傷、病原感染、肥胖、遺傳、年齡、飲食和炎癥等［7］。

多種炎癥因子與OA的發(fā)生有密切關(guān)系，影響軟骨損失的進(jìn)展并引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬等臨床表現(xiàn)［8］。在這些炎癥介質(zhì)中，白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和趨化因子對(duì)OA較為重要。IL-1β可通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡［9-11］、降低Ⅱ型膠原和軟骨細(xì)胞中聚集蛋白聚糖的表達(dá)［12］等方式損傷軟骨。此外，IL-1β和TNF-α還可通過刺激其他多種炎癥因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的生成，促進(jìn)OA進(jìn)展。

人參皂苷已被證實(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟、氣道、腸道等多種器官組織具有抗炎作用［13-17］。多項(xiàng)研究顯示，人參皂苷可抑制IL-1β和TNF-α，減緩關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展或嚴(yán)重程度［18-19］。TSPG可通過抑制促炎因子，上調(diào)保護(hù)性細(xì)胞因子，從而抑制骨關(guān)節(jié)破壞，緩解疼痛癥狀。TSPG還具有抑制細(xì)胞凋亡，改善骨質(zhì)破壞和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，人參總皂苷可抑制滑膜成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）［20］。此外，研究顯示人參皂甙Rg1，Rb2，Rg5等均可抑制OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)損傷，從而預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨的破壞［21-23］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，壓痛值和熱痛值降低（P<0.01），關(guān)節(jié)面破損嚴(yán)重，軟骨基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞丟失，提示碘乙酸造模效果良好。TSPG-L組、TSPG-M組、TSPG-H組以關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射連續(xù)治療4周后，各治療組壓痛值均高于模型組，且與劑量呈正相關(guān)，提示TSPG能緩解OA大鼠炎性疼痛，提高足部痛閾值。各治療組熱痛閾值相較模型組上升，與各治療組劑量無明顯相關(guān)性。軟骨細(xì)胞CCK實(shí)驗(yàn)顯示，人參皂苷組細(xì)胞增值率提高，且與濃度有關(guān)。組織學(xué)病理切片顯示，治療組ORASI評(píng)分均降低，提示TSPG可以明顯修復(fù)受損的軟骨面、軟骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。

綜上所述，TSPG對(duì)改善關(guān)節(jié)疼痛、修復(fù)受損軟骨療效顯著，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子，減少軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)損傷，促進(jìn)軟骨細(xì)胞修復(fù)有關(guān)。