徐蕾蕊，李 丹，魏詠新，馬 丹，魏海燕，汪 琦，張西萌，付溥博，劉 莉，趙曉娟，曾 靜

（中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心 北京100026）

1975年Appleton 等[1]在腸胃炎患者糞便中首次發(fā)現(xiàn)HAstV，其為一種無(wú)衣殼的單股正鏈RNA病毒，具有5～6 個(gè)小角，呈星星狀。星狀直徑28～35 nm，基因組全長(zhǎng)6.8 kb，包含5’非編碼區(qū)（Noncoding region，NCR）和ORF1a、ORF1b、ORF2 共3個(gè)開(kāi)放閱讀框。HAstV 分為8 個(gè)血清型，其中，可在嬰幼兒、年長(zhǎng)者和免疫低下人群中引起嚴(yán)重的急性病毒性腸胃炎的血清型是人星狀病毒1 型（Human astrovirus type1，HAstV-1）[2]。

食源性病毒的感染劑量非常低，10～200 個(gè)病毒粒子即可引起感染，在人體腸道中經(jīng)過(guò)繁殖后，通過(guò)糞便污染環(huán)境，并進(jìn)一步通過(guò)受糞便污染的水或者淤泥、土壤等諸多途徑傳播[3]。鑒于此，需要提高HAstV 檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，建立一種簡(jiǎn)便易操作的食品中HAstV 定量檢測(cè)方法，對(duì)食品中HAstV 污染水平實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)控。本研究應(yīng)用RT-ddPCR，建立了一種快速、簡(jiǎn)便定量檢測(cè)食品中HAstV 的方法，為開(kāi)展食品中HAstV 等食源性病毒暴露評(píng)估工作提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HAstV、輪狀病毒、諾如病毒、甲肝病毒RNA，本實(shí)驗(yàn)室保存；MS2 噬菌體懸液，本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNAⅡ載體，美國(guó)Invitrogen 公司；焦碳酸二乙酯（Diethyl paracabonate，DEPC）處理H2O，北京天根生化科技有限公司；總RNA 抽提試劑Trizol，美國(guó)Invitrogen 公司；乙醇、異丙醇、氯仿、異戊醇，北京化學(xué)試劑公司；核糖核酸酶抑制劑（Recombinant RNasin?ribonuclease inhibitor），美國(guó)Promega 公司；一步法定量實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒（SuperScript?ⅢPlatinum?one-step quantitative RT-PCR system），美國(guó)Invitrogen 公司；病毒核糖核酸提取試劑盒（QIAamp viral RNA mini kit），德國(guó)QIAGEN 公司；蛋白酶K，天根生化科技（北京） 有限公司；核糖核酸磁珠純化試劑盒（Dynabeads?mRNA purification kit），美國(guó)Life Technology 公司；微滴生成油，美國(guó)Bio-Rad 公司。

7900HT Fast 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀、Veriti 96-Well 熱循環(huán)儀，美國(guó)ABI 公司；QX200 微滴數(shù)字PCR 系統(tǒng)、8 孔微滴生成卡、QX200 微滴生成儀、鋁箔熱封膜，美國(guó)Bio-Rad 公司；CP413 電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物探針設(shè)計(jì)和特異性篩選 根據(jù)HAstV ORF2 中編碼衣殼蛋白的靶序列，利用Prime Express V4.0 設(shè)計(jì)HAstV 特異性引物和探針組合。提取HAstV RNA 后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）篩選引物探針。

1.2.2 引物探針的特異性驗(yàn)證 應(yīng)用HAstV 和輪狀病毒、甲肝病毒、諾如病毒RNA，驗(yàn)證引物探針的特異性。反應(yīng)體系包括2×一步法逆轉(zhuǎn)錄微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)預(yù)混液（2×One-step RTddPCR supermix） 15 μL，25 mmol/L 醋酸鎂（Manganese acetate solution） 0.8 μL，上游引物/下游引物（10 μmol/L） 各1.8 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，RNA 模板2 μL，DEPC 處理水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)步驟：將20 μL 以上反應(yīng)體系和65 μL 微滴生成油分別加入到8 孔微滴生成卡內(nèi)，QX200 微滴生成儀內(nèi)生成微滴。將生成的微滴（約40 μL）緩慢轉(zhuǎn)移到96 孔板內(nèi)，鋁箔熱封膜處理后，置于Veriti 96-Well 熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，在微滴讀取儀中測(cè)量反應(yīng)體系中RNA 模板濃度，計(jì)算樣品RNA 模板濃度。

1.2.3 RT-ddPCR 條件優(yōu)化 將1.2.2 節(jié)中反應(yīng)體系分別在不同退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，比較不同擴(kuò)增溫度下的擴(kuò)增效率，優(yōu)化得到最佳退火溫度。

1.2.4 HAstV RT-ddPCR 的定量低限、準(zhǔn)確度、重復(fù)性分析

1.2.4.1 HAstV RNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備 利用pcDNAII 載體構(gòu)建含HAstV RT-ddPCR 檢測(cè)目的序列的重組質(zhì)粒，單酶切后體外轉(zhuǎn)錄合成獲得含HAstV RT-ddPCR 檢測(cè)方法目的序列的RNA 片段，研制HAstV RNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品，并按照ISO Guide 35：2006[4]要求，確定其特性值。

1.2.4.2 定量低限和準(zhǔn)確度 多倍梯度稀釋HAstV RNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)梯度各取2 μL，采用RT-ddPCR 檢測(cè)，反應(yīng)體系同1.2.2 節(jié)。各稀釋梯度重復(fù)檢測(cè)4 次，計(jì)算測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD），分析確定RTddPCR 測(cè)量值與理論值的相關(guān)性，確定定量低限，驗(yàn)證準(zhǔn)確度。

1.2.4.3 重復(fù)性 取3 份HAstV RNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品按10 倍梯度分別稀釋，采用RT-ddPCR 分別檢測(cè)各份標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋系列中的高、低2 個(gè)梯度，每個(gè)梯度各取2 μL，每份樣品各梯度分別進(jìn)行6 次重復(fù)檢測(cè)，反應(yīng)體系同1.2.2 節(jié)，同時(shí)設(shè)置1 個(gè)空白對(duì)照（以DEPC 水代替模板RNA）。計(jì)算測(cè)量值與理論值偏差，確定重復(fù)性。

1.2.5 不同種類(lèi)食品基質(zhì)的檢測(cè)限和回收率 采用MS2 噬菌體制備人工污染樣品。采用雙層瓊脂培養(yǎng)法[5]確定MS2 噬菌體懸液中MS2 噬菌體效價(jià)為7.2×108PFU（噬菌斑形成單位，Plaque forming unit）/μL，制備 成7.2×105，7.2×104，7.2×102，7.2×101，3.6×101，1.8×101PFU/μL 梯度稀釋液，作為HAstV 模擬污染液。

1.2.5.1 食品基質(zhì)種類(lèi)及來(lái)源 食品基質(zhì)種類(lèi)：貝類(lèi)消化腺（牡蠣）、硬表面食品（蘋(píng)果）、生食蔬菜（生菜）和酸性軟質(zhì)水果（草莓）。所有樣品均購(gòu)自超市，購(gòu)入后立即進(jìn)行人工污染或者分別保存于-80 ℃（牡蠣）和4 ℃（蘋(píng)果、生菜、草莓），人工污染前，去除外殼不完整的牡蠣樣品，用無(wú)菌水沖掉生菜、蘋(píng)果和草莓樣品表面的泥沙和浮塵，晾干表面水珠后備用。

1.2.5.2 人工污染樣品制備 牡蠣：剝離出消化腺，勻漿后，分為2 g/份，添加100 μL 模擬污染液，室溫靜置30 min，每個(gè)污染梯度均設(shè)置3 份樣品，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3 次。

蘋(píng)果：取100 μL 模擬污染液點(diǎn)涂到表面，涂抹面積≤100 cm2，室溫靜置30 min，每個(gè)污染梯度均設(shè)置3 份樣品，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3 次。

生菜：稱取生菜25 g，取100 μL 模擬污染液點(diǎn)涂到表面，室溫靜置30 min，每個(gè)污染梯度均設(shè)置3 份樣品，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3 次。

草莓：稱取草莓25 g，取100 μL 模擬污染液點(diǎn)涂到表面，室溫靜置30 min，每個(gè)污染梯度均設(shè)置3 份樣品，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3 次。

1.2.5.3 人工污染樣品前處理及核酸提取 不同種類(lèi)人工污染食品樣品中的病毒洗脫和濃縮等前處理操作均按ISO/TS 15216-2：2013[6]標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。用Trizol 方法提取前處理液中的病毒RNA，采用100 μL DEPC 水溶解提取的RNA。取50 μL 直接用RT-ddPCR 檢測(cè)，剩余的50 μL 核酸經(jīng)磁珠純化試劑盒純化后再用RT-ddPCR 檢測(cè)。

1.2.5.4 MS2 噬菌體RT-ddPCR 檢測(cè)方法 參考文獻(xiàn)[7-8]研究中的引物和探針（表1），建立MS2噬菌體RT-ddPCR 檢測(cè)方法。反應(yīng)體系及微滴生成、核酸含量計(jì)算同1.2.2 節(jié)所述方法。

1.2.5.5 計(jì)算人工污染樣品回收率 回收率為經(jīng)RT-ddPCR 方法得到的人工污染樣品檢測(cè)值與添加的模擬污染液理論值的比值，判定人工污染樣品中模擬病毒的回收和病毒RNA 提取的有效性時(shí)，要求該回收率＞1%。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用t-檢驗(yàn)和F-檢驗(yàn)比較組間均數(shù)，P＜0.05 時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針特異性

根據(jù)HAstV ORF2 編碼衣殼蛋白靶序列，設(shè)計(jì)引物探針3 組，以及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2519-2010中HAstV 引物探針ORF2-F1/ORF2-R1/ORF2-P1，用于RT-ddPCR 引物探針篩選。qRT-PCR 對(duì)設(shè)計(jì)的引物探針篩選結(jié)果表明：僅ORF2-F4/ORF2-R4/ ORF2-P4（序列未給出）不能擴(kuò)增出靶基因，且ORF2-F1/ ORF2-R1/ ORF2-P1 信號(hào)最強(qiáng)（圖1）。特異性驗(yàn)證說(shuō)明，ORF2-F1/ ORF2-R1/ORF2-P1（序列見(jiàn)表1）對(duì)輪狀病毒、甲肝病毒和諾如病毒RNA 均無(wú)擴(kuò)增（圖2）。

圖1 HAstV 引物探針篩選Fig.1 HAstV primer and probe filtrating

圖2 ORF2-F1/ ORF2-R1/ ORF2-P1 特異性驗(yàn)證Fig.2 Specificity of ORF2-F1/ ORF2-R1/ ORF2-P1

表1 RT-ddPCR 反應(yīng)引物探針序列Table 1 Primer and probe sequence for RT-ddPCR

2.2 建立及優(yōu)化HAstV RT-ddPCR 方法

2.2.1 RT-ddPCR 方法 篩選出引物探針OFR2-F1/ ORF2-R1/ ORF2-P1 后，建立HAstV RTddPCR 方法。根據(jù)RT-ddPCR 特異性結(jié)果表明（圖3），僅HAstV RNA 出現(xiàn)陽(yáng)性微滴，且在對(duì)體系擴(kuò)增溫度進(jìn)行優(yōu)化前，陽(yáng)性、陰性微滴簇之間有明顯分界；其它病毒RNA 均未出現(xiàn)陽(yáng)性微滴，可見(jiàn)該RT-ddPCR 方法對(duì)HAstV RNA 特異性良好。

2.2.2 退火溫度的優(yōu)化 由圖4可知，目的基因片段擴(kuò)增效率在退火溫度為55 ℃或60 ℃時(shí)均比較高，陽(yáng)性微滴簇比較明顯，60 ℃時(shí)，陽(yáng)性微滴的熒光信號(hào)強(qiáng)度略高于55 ℃。故60 ℃為優(yōu)化的退火溫度。

圖3 HAstV RT-ddPCR 方法特異性Fig.3 Specificity of HAstV RT-ddPCR assay

圖4 優(yōu)化HAstV RT-ddPCR 方法退火溫度Fig.4 Annealing temperature optimizing of HAstV RT-ddPCR assay

2.3 HAstV RNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品

采用篩選出的特異性引物ORF2-F1/R1 擴(kuò)增出含HAstV RT-ddPCR 目的序列的DNA 片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNAII-HAstV，將該重組質(zhì)粒線性化酶切后，采用T7 啟動(dòng)子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到大約310 bp 的RNA 片段，將該片段的測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI 在線工具BLAST 進(jìn)行序列分析和比對(duì)，與GenBank 中HAstV-1 的基因序列的同源性可達(dá)100%，說(shuō)明成功構(gòu)建了含HAstV RT-ddPCR目的序列的RNA 片段。將該RNA 片段稀釋，分裝保存于-80 ℃。采用多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值方法確定該HAstV RNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值為5.52×106拷貝/μL。

2.4 HAstV RT-ddPCR 方法的定量低限和準(zhǔn)確度

多倍梯度稀釋HAstV RNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品，理論值分別為552 000.00，55 200.00，5 520.00，552.00，55.20，27.60，13.80，5.52 拷貝/μL。結(jié)果表明，552 000.00 拷貝/μL 超過(guò)了HAstV RT-ddPCR 檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍；在552 000.00～5.52 拷貝/μL范圍內(nèi)，各稀釋度定量結(jié)果的RSD 值為3.7%～15.6%（表2），RT-ddPCR 測(cè)量值與理論值呈正相關(guān)，直線回歸方程和決定系數(shù)分別為Y=1.050X-50.214，R2=0.9972（P＜0.0001），說(shuō)明HAstV RTddPCR 檢測(cè)值與理論值相符，可定量檢測(cè)HAstV RNA 濃度（圖5）。濃度低至5 拷貝/μL 左右時(shí)，測(cè)量值RSD值小于25%，與理論值十分接近，說(shuō)明HAstV RT-ddPCR 方法的定量低限為5 拷貝/μL。

2.5 HAstV RT-ddPCR 方法的重復(fù)性

高濃度的檢測(cè)RSD 值分別為11.86%，7.48%和10.40%，3 份平行樣品的定量結(jié)果分別為5 310.67，5 511.50，5 561.83 拷貝/μL，與理論值的偏差分別為3.79%，0.15%，0.76%；低濃度的檢測(cè)RSD 分別為7.74%，5.51%和10.44%，3 份平行樣品定量結(jié)果分別為5.30，5.63，4.98 拷貝/μL，與理論值的偏差分別為3.99%，1.99%和9.78%（表3）。結(jié)果表明，檢測(cè)方法的重復(fù)性較好，同時(shí)高濃度的稀釋梯度3 個(gè)平行樣品的測(cè)量偏差總體上均低于低濃度的稀釋梯度（圖6）。由此可見(jiàn)，RT-ddPCR檢測(cè)方法需要選擇適合的稀釋梯度對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，樣品在稀釋時(shí)的均勻性對(duì)HAstV RT-ddPCR的定量結(jié)果有較大影響。

表2 HAstV RT-ddPCR 方法的定量低限與準(zhǔn)確度Table 2 Lower limit of quantification and accuracy of HAstV RT-ddPCR assay

表3 HAstV RT-ddPCR 檢測(cè)方法的重復(fù)性Table 3 Repeatability of HAstV RT-ddPCR assay

圖5 HAstV RT-ddPCR 方法的線性相關(guān)性Fig.5 Linear relationship of HAstV RT-ddPCR assay

圖6 HAstV RT-ddPCR 檢測(cè)方法的精密度Fig.6 Precision of HAstV RT-ddPCR assay

2.6 不同種類(lèi)食品基質(zhì)中的檢測(cè)限

由表4可見(jiàn)，模擬病毒顆粒添加量為1.8×103拷貝時(shí)，牡蠣消化腺和蘋(píng)果樣品檢出量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）均大于25%；模擬病毒顆粒添加量為3.6×103拷貝時(shí)，生菜和草莓樣品的檢出量RSD 值均大于25%。因此，貝類(lèi)消化腺（牡蠣）和硬表面食品（蘋(píng)果）樣品中食源性病毒檢測(cè)限為7.2×106～3 600 拷貝，生食蔬菜（生菜） 樣品中食源性病毒的檢測(cè)限為7.2×106～7 200 拷貝，軟質(zhì)水果（草莓）樣品中食源性病毒檢測(cè)限為7.2×107～7 200 拷貝。t-檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同種類(lèi)食品基質(zhì)樣品中模擬病毒的添加量較高時(shí)，磁珠純化的病毒檢出量明顯低于未經(jīng)磁珠純化的病毒檢出量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明磁珠純化后的模擬病毒模板含量降低，從人工污染樣品提取的模擬病毒模板含量超過(guò)了磁珠純化的最大載量；樣品中模擬病毒的添加量為7 200～1 800 拷貝時(shí)，磁珠純化沒(méi)有明顯提高各添加梯度樣品的模擬病毒檢出量，說(shuō)明RT-ddPCR檢測(cè)方法對(duì)擴(kuò)增抑制劑有較高的耐受性，這與數(shù)字PCR 的原理有關(guān)。

表5顯示，貝類(lèi)消化腺（牡蠣）、硬表面食品（蘋(píng)果）、生食蔬菜（生菜）和軟質(zhì)水果（草莓）樣品中模擬病毒回收率分別為18.98%～64.57%，11.55%～69.44%，9.12%～45.37%和2.49%～13.57%，其中，生食蔬菜和軟質(zhì)水果的回收率低于貝類(lèi)消化腺和硬表面食品。單因素試驗(yàn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各污染劑量的不同種類(lèi)食品基質(zhì)的模擬病毒回收率之間存在顯著性差異（P＜0.001），Turkey 多重比較分析發(fā)現(xiàn)，各污染劑量下，不同種類(lèi)食品基質(zhì)的回收率之間均有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

目前，qRT-PCR 方法是HAstV 分子檢測(cè)的主要標(biāo)準(zhǔn)方法[6，9-10]，該方法定量檢測(cè)食品中星狀病毒核酸時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和使用過(guò)程會(huì)給qRTPCR 定量結(jié)果引入額外偏倚[11]。qRT-PCR 定量檢測(cè)的前提是未知樣本的擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率完全一致，然而實(shí)際試驗(yàn)中，未知樣本提取的核酸中可能存在擴(kuò)增抑制劑，產(chǎn)生額外偏倚[12-13]。與qRT-PCR 相比，微滴數(shù)字PCR 不需要循環(huán)閾值標(biāo)準(zhǔn)曲線，可直接定量檢測(cè)模板拷貝濃度，對(duì)核酸中的抑制劑有更好的耐受性[14-15]，在提高核酸定量分析準(zhǔn)確性和可靠性的優(yōu)勢(shì)比較明顯。Tang 等[16]比較ddPCR 與qRT-PCR 對(duì)HBV 病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品定量結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，ddPCR 對(duì)低拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的定量結(jié)果重復(fù)性優(yōu)于qRT-PCR，兩種方法對(duì)實(shí)際樣品的定量結(jié)果具有很高的一致性。Hayden 等[17]指出，ddPCR 對(duì)高濃度巨細(xì)胞病毒標(biāo)準(zhǔn)品定量結(jié)果的變異系數(shù)較小，qRT-PCR 對(duì)于濃度較低的實(shí)際樣品的變異系數(shù)較小且靈敏度更高。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，ddPCR 能夠從qRT-PCR 檢測(cè)為陰性的咽拭子標(biāo)本中檢測(cè)出流感病毒載量，檢測(cè)靈敏度更高[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，HAstV RT-ddPCR 定量結(jié)果與理論濃度相符，相關(guān)系數(shù)為0.9972，定量范圍可包括104～100（拷貝/μL）5 個(gè)數(shù)量級(jí)，最低定量限可達(dá)5 拷貝/μL，檢測(cè)方法顯示了良好的重復(fù)性。

由于HAstV 陽(yáng)性生物樣品有一定的生物安全問(wèn)題，且培養(yǎng)純化步驟繁瑣，病毒濃度需要通過(guò)病毒侵染相應(yīng)的宿主細(xì)胞系來(lái)確認(rèn)，采用HAstV顆粒制備人工污染陽(yáng)性樣品的操作比較難以實(shí)現(xiàn)。MS2 噬菌體是一種無(wú)包膜+ssRNA 病毒，大小和結(jié)構(gòu)與HAstV 比較接近，可通過(guò)雙層瓊脂法確定病毒滴度，且對(duì)人體沒(méi)有致病性[19]。本研究采用MS2 噬菌體模擬HAstV，制備人工污染樣品，探索不同種類(lèi)食品基質(zhì)HAstV RT-ddPCR 檢測(cè)限。研究結(jié)果表明貝類(lèi)消化腺樣品和硬表面食品、生食蔬菜、軟質(zhì)水果的檢測(cè)限分別為：7.2×106～3 600 拷貝，7.2×106～7 200 拷貝和7.2×107～7 200 拷貝。

采用RT-ddPCR 方法對(duì)食品中HAstV 進(jìn)行定量檢測(cè)，其關(guān)鍵在于針對(duì)不同種類(lèi)食品基質(zhì)采用合適的前處理方法。目前，應(yīng)用最多的前處理方法為病毒顆粒洗脫-濃縮法[20]。本研究將常見(jiàn)的食源性病毒污染的食品分為貝類(lèi)消化腺、硬表面食品、軟質(zhì)水果和生食蔬菜4 種食品基質(zhì)類(lèi)型，參照ISO/TS 15216-2：2013[6]對(duì)人工污染樣品進(jìn)行前處理。通過(guò)計(jì)算回收率發(fā)現(xiàn)，不同基質(zhì)樣品的回收率不同，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明不同種類(lèi)食品基質(zhì)中病毒顆粒的洗脫-濃縮效率和RNA 提取效率不同。其中，生食蔬菜和軟質(zhì)水果的回收率明顯低于其它2 種食品基質(zhì)。對(duì)于軟質(zhì)水果和生食蔬菜這些酸性成分含量較高的食品基質(zhì)表面的食源性病毒，通常采用pH≥9 的堿性緩沖液洗脫[21]，并在洗脫液中加入牛肉膏和甘氨酸，以降低病毒顆粒的非特異性吸附[22-23]，洗脫條件苛刻，操作繁瑣；此外，樹(shù)莓、草莓水果含果膠比較多，會(huì)對(duì)洗脫效果產(chǎn)生影響，降低回收率。病毒洗脫后通常采用PEG 沉降方法進(jìn)行病毒濃縮[21]，回收率優(yōu)于超速離心方法[24-25]。也有研究表明，PEC沉降方法可分別從添加了104，106個(gè)病毒拷貝/10 g 冷凍樹(shù)莓樣品中成功回收GI 和GII 2 個(gè)基因型諾如病毒顆粒，回收率分別為7.4%～61.1%和20.7%～47.7%[21，26]。

）（n=9限測(cè)檢的法方測(cè)檢RT-ddPCR毒病性源食中質(zhì)基品食類(lèi)種同不4表）（n=9 Limit of detection of RT-ddPCR assay for foodborne viruses in different food matrices Table 4 莓草菜生果蘋(píng)蠣牡珠磁/量劑染污驗(yàn)檢t-RSD/%貝拷/量出檢驗(yàn)檢t-RSD/%貝拷/量出檢驗(yàn)檢t-RSD/%貝拷/量出檢驗(yàn)檢t-RSD/%貝拷/量出檢化純貝拷t=3.963 20.19 4 113 500---------無(wú)7 7.2×10 P=0.003 14.39 2 639 000------有t=-0.038 5.33 975 000 t=-0.155 20.00 1 144 000 t=5.022 9.63 1 871 500 t=5.797 12.26 4 649 333無(wú)6 7.2×10 P=0.971 13.31 977 167 P=0.880 18.10 1 163 833 P=0.001 10.87 1 382 833 P＜0.001 18.44 2 817 333有t=-3.425 13.90 331 0 t=2.251 9.28 9 683 t=5.255 16.79 13 717 t=4.926 12.71 35 367無(wú)4 7.2×10 P=0.012 5.00 400 5 P=0.048 15.66 8 267 P＜0.001 12.05 8 317 P=0.001 16.10 23 617有t=-1.096 14.12 262 t=0.850 23.24 3 267 t=1.888 23.33 4 800 t=1.023 15.53 3 667無(wú)3 7.2×10 P=0.299 16.96 289 P=0.415 17.36 2 950 P=0.088 21.72 3 733 P=0.330 10.95 3 383有t=-1.804 110.0 90 t=-0.098 87.88 328 t=1.379 13.20 2 500 t=0.868 11.04 1 633無(wú)3 3.6×10 P=0.101 58.62 203 P=0.924 82.86 345 P=0.113 17.21 2 150 P=0.406 18.42 1 517有------t=1.272 29.52 1 047 t=-0.276 61.76 342無(wú)3 1.8×10----P=0.232 34.94 825 P=0.788 55.26 375有。據(jù)數(shù)出檢有沒(méi)量劑染污該。-.數(shù)倍釋稀×積體×RNA值度濃貝拷RNA，即值均平的數(shù)貝拷總段片的目毒病性源食中品樣染污工人為量出：檢注

）（n=9果結(jié)算計(jì)率收回平水染污同不中質(zhì)基品食類(lèi)種同不5表）（n=9 Comparison of recovery rate in different food matrices Table 5 莓草菜生果蘋(píng)蠣牡析分差方素因單貝拷/量劑染污/%率收回-5.71±1.15---7 7.2×10，P＜0.001 F=166.788 13.54±0.72 15.89±3.22 25.99±2.54 64.57±7.96 6 7.2×10 F=176.685，P＜0.001 4.60±0.64 13.45±1.23 19.05±3.20 49.12±6.21 4 7.2×10，P＜0.001 F=4.785 3.63±0.51 45.37±10.49 66.67±15.57 50.93±7.94 3 7.2×10，P＜0.001 F=131.096 2.49±2.74 9.12±8.19 69.44±9.13 45.37±4.86 3 3.6×10，P=0.001 F=21.012--58.15 ± 17.34 18.98 ± 11.72 3 1.8×10。據(jù)數(shù)出檢有沒(méi)量劑染污該示：“-”表注

本研究建立的食品中HAstV 定量方法可概括為HAstV 與食品基質(zhì)洗脫、濃縮后，提取HAstV RNA，RT-ddPCR 方法定量樣品中HAstV RNA 含量，不考慮HAstV 回收率，靈敏度理論上可達(dá)5拷貝/μL。在實(shí)際檢測(cè)食品樣品時(shí)，HAstV 濃縮回收率和RNA 提取率都不可能達(dá)到100%，RTddPCR 定量檢測(cè)結(jié)果不能反映實(shí)際樣品中HAstV實(shí)際載量。因此在后續(xù)研究中，需要建立過(guò)程控制方案，反應(yīng)實(shí)際樣品中HAstV 回收率，通過(guò)該回收率可以實(shí)現(xiàn)食品樣品中HAstV 的實(shí)際載量的檢測(cè)和計(jì)算。