許 女，楊 光，王 璐，張 浩，王如福

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801）

羊肉具有比其它畜肉更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，我國(guó)是生產(chǎn)羊肉的第一大國(guó)，尤其是山西塞外地區(qū)的懷仁、右玉及內(nèi)蒙地區(qū)，其得天獨(dú)厚的自然條件成為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羊肉的重要基地。我國(guó)生產(chǎn)的羊肉基本以內(nèi)銷為主，冷凍肉占到產(chǎn)品的95%以上。冷鮮肉的生產(chǎn)非常少，而冷鮮肉具有冷凍肉所不能比擬的優(yōu)勢(shì)?？v觀國(guó)際市場(chǎng)，發(fā)達(dá)國(guó)家的羊肉生產(chǎn)過(guò)程中廣泛應(yīng)用全程標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)、保鮮技術(shù)以及高新食品工程技術(shù)，從而提高了其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力。尤其是在澳大利亞和新西蘭等羊肉出口大國(guó)，由于保鮮技術(shù)先進(jìn)，使羊肉在非冷凍條件下的保質(zhì)期達(dá)21 d 以上，因此遠(yuǎn)銷世界各地[1]。解決冷鮮肉的保藏問(wèn)題，即打破了限制冷鮮羊肉推廣和出口的瓶頸。

與化學(xué)保鮮劑相比，生物保鮮劑具有高效、安全等優(yōu)點(diǎn)，主要為植物源、動(dòng)物源和微生物源。植物源保鮮劑主要是香辛料（生姜、大蒜、迷迭香等）、中草藥（當(dāng)歸、連翹等）及茶葉（茶多酚）等提取物；動(dòng)物源保鮮劑主要指殼聚糖、抑菌蛋白和抑菌肽。目前最具有開(kāi)發(fā)前景的是微生物源保鮮劑，微生物的代謝物質(zhì)如：酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫、誘導(dǎo)酶及溶菌酶等都具有抑菌和殺菌活性，很多已成功地用于商業(yè)開(kāi)發(fā)，如乳酸鏈球菌素Nisin 等。涉及的微生物菌種主要包括兩大類：（1） 乳酸菌：植物乳桿菌、乳酸乳球菌、雙歧桿菌、戊糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、彎曲乳桿菌、乳酸片球菌、短乳桿菌、糞腸球菌等；（2）芽孢菌：解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。Chaillou 等[2]研究了幾種清酒乳桿菌的混合菌種對(duì)牛肉的保鮮作用，熒光定量PCR 結(jié)果顯示，清酒乳桿菌顯著抑制了真空和氣調(diào)包裝牛肉糜中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了其貨架期。Miao 等[3]證明1.2%的副干酪乳桿菌FX-6 抑菌液，可使冷鮮豬肉的貨架期延長(zhǎng)到12 d。云美林[4]采用清酒乳桿菌、植物乳桿菌與海藻酸鈉混合制成的生物抑菌涂膜法，在4 ℃條件下，將冷鮮羊肉的保質(zhì)期延長(zhǎng)至12～16 d。

本文自山西老陳醋醋醅中分離1 株凝結(jié)芽孢桿菌VP4，研究產(chǎn)生細(xì)菌素的pH 值、熱穩(wěn)定性及在冷鮮羊肉保藏中的作用，為天然生物保鮮劑的開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，對(duì)指導(dǎo)冷鮮肉的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，提高其保質(zhì)期、安全性等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌菌株，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保存。

MRS（乳酸菌培養(yǎng)、計(jì)數(shù)）、NA（芽孢菌培養(yǎng)）、BHI（病原菌培養(yǎng)）、PCA（菌落總數(shù)計(jì)數(shù)）、GSP（假單胞菌選擇性計(jì)數(shù)）、VRB（腸桿菌選擇性計(jì)數(shù)）培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌提基因組試劑盒，北京博邁德科技發(fā)展有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)緩沖液、10×Loading Buffer，大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI 公司；電泳成套設(shè)備，美國(guó)Bio-rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Alpha Innotech 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma 公司；電導(dǎo)儀，梅特勒-托利多儀器有限公司；色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)CR-400。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌菌株的抑菌活性測(cè)定 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備：乳酸菌菌種經(jīng)MRS 培養(yǎng)基活化后，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，8 000 r/min 離心15 min，收集上清液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

抑菌試驗(yàn)：將指示菌按2%的接種量接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min 搖床過(guò)夜，稀釋到107CFU/mL 備用。吸取150 μL 指示菌（107CFU/mL） 涂布于LB 瓊脂平板上，常溫干燥30 min。將200 μL 上述菌株發(fā)酵上清液加入牛津杯內(nèi)，4 ℃冰箱中靜置4 h 后，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑（d）。

1.3.2 乳酸菌菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 對(duì)抑菌活性強(qiáng)的菌株進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的初步鑒定 按照文獻(xiàn)[5]的方法對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行有機(jī)酸、過(guò)氧化氫的排除試驗(yàn)，并研究蛋白酶對(duì)上清液抑菌活性的影響。

1.3.4 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素的pH 值和熱穩(wěn)定性測(cè)定 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：將發(fā)酵上清液分別在60，100，121 ℃下處理30，60 min，測(cè)定其抑菌活性。

酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別用濃度為1.0 mol/L 的HCl，NaOH 溶液，將發(fā)酵上清液的pH 值調(diào)至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，于30 ℃下處理1 h，然后將pH 值調(diào)回至中性，測(cè)定其抑菌活性。

1.3.5 掃描電鏡試驗(yàn) 將凝結(jié)芽孢桿菌VP4 發(fā)酵上清液調(diào)至中性，濃縮5 倍后，按10%（體積分?jǐn)?shù)）的添加量，分別加入到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的懸液中（106CFU/mL），37 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集菌體細(xì)胞，空白對(duì)照組加入10%的空白NA 培養(yǎng)基上清液。按照文獻(xiàn)[6]的方法，固定，漂洗，脫水，干燥，鍍膜，掃描電鏡觀察。

1.3.6 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素在冷鮮羊肉保藏中的應(yīng)用

1.3.6.1 VP4 細(xì)菌素處理液的制備 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 按3%的接種量接種于NA 培養(yǎng)基中，160 r/min，37 ℃培養(yǎng)24 h，8 000 r/min 離心15 min，收集上清液，調(diào)pH 值為中性后，80%的硫酸銨沉淀過(guò)夜，透析，真空冷凍干燥制成粉，用無(wú)菌水配制成質(zhì)量濃度6 g/100 mL 和8 g/100 mL，備用。

1.3.6.2 冷鮮羊肉的處理 取羊后腿肉切成質(zhì)量約80 g 的小塊分成3 組，分別是對(duì)照組、6%VP4細(xì)菌素處理組和8%VP4 細(xì)菌素處理組，每組10塊。經(jīng)紫外照射10 min，每組肉塊在對(duì)應(yīng)的處理液中浸漬1 min 后取出（對(duì)照組的處理液為無(wú)菌水），擺于無(wú)菌盤(pán)篩中，置于超凈臺(tái)中無(wú)菌風(fēng)吹10 min 至表面溶液稍干，保鮮膜托盤(pán)包裝，放入（4±1）℃的冰箱中貯藏。每隔3 d 抽樣，測(cè)定pH 值、電導(dǎo)率、TVB-N、TBA、色差值、微生物指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)。

1.3.6.3 理化及微生物指標(biāo)的測(cè)定

1） 微生物指標(biāo)的測(cè)定 總菌數(shù)、乳酸菌、假單胞菌、腸桿菌分別采用PCA、MRS、GSP 和VRB培養(yǎng)基測(cè)定。

2） 理化指標(biāo)的測(cè)定 按照文獻(xiàn)[7]的方法測(cè)定冷鮮羊肉的pH 值、電導(dǎo)率、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和硫代巴比妥酸（TBA）值。采用TCP2 型全自動(dòng)色差計(jì)測(cè)定冷鮮羊肉的肉色。用亨特系統(tǒng)表示，以標(biāo)準(zhǔn)白板為標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照，測(cè)定肉樣表面的L 值和a 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌活性乳酸菌菌株的篩選、鑒定

按照1.3.1 中的方法，考察分離自醋醅、泡菜、傳統(tǒng)乳制品和青貯飼料中的10 株乳酸菌對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。菌株EL172，SK2，VP4 的抑菌活性最強(qiáng)，經(jīng)16S rDNA 測(cè)序分別鑒定為發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖1。

表1 具有抑菌活性乳酸菌的篩選Table 1 Antibacterial activity of LAB candidate strains

圖1 基于16S rDNA 序列的乳酸菌進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Dendrogram of LAB isolates based on 16S rDNA sequence

2.2 乳酸菌菌株抑菌物質(zhì)的初步鑒定

乳酸菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的二氧化碳、有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等物質(zhì)都具有抑菌活性。表2結(jié)果顯示，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值為7.0 的EL172和VP4 菌株發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑雖略有減小，但變化不大，仍具有很強(qiáng)的抑菌活性。而SK2菌株的發(fā)酵上清液調(diào)pH 值為7.0 時(shí)抑菌活性喪失，表明其產(chǎn)生抑菌活性的主要物質(zhì)是代謝產(chǎn)物中的酸類。

經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后，EL172 和VP4 菌株的抑菌效果未見(jiàn)明顯變化，故排除過(guò)氧化氫所起的抑菌作用。被蛋白酶K 和胰蛋白酶作用后抑菌圈消失，說(shuō)明這2 株菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶K、胰蛋白酶敏感，可初步確定是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，為細(xì)菌素類。據(jù)報(bào)道，幾乎所有的細(xì)菌都能產(chǎn)生至少1種細(xì)菌素或細(xì)菌素類似物，這是細(xì)菌存在的自我防御機(jī)制。對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生菌的研究大都集中在乳酸菌和芽孢菌中，然而鮮有關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)菌素的報(bào)道。趙鈺[8]分離了1 株具有抑菌活性的凝結(jié)芽孢桿菌LL1103，證明胞外抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素類物質(zhì)乳桿菌素（lactocin）。凝結(jié)芽孢桿菌又稱乳酸芽孢桿菌，同型發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，被美國(guó)藥品食品監(jiān)督管理局（FDA）認(rèn)定為安全有效的益生菌。本文從醋醅中分離出1 株具有強(qiáng)抑菌活性的凝結(jié)芽孢桿菌，并且證明抑菌活性成分為細(xì)菌素類物質(zhì)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

表2 不同處理對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌VP4 發(fā)酵上清液抑菌作用的影響Table 2 The effect of different treatment on antimicrobial activity of fermented supernatant of Bacillus coagulans VP4

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素的pH 值及熱穩(wěn)定性

將發(fā)酵上清液在不同溫度下處理不同時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表3。60 ℃處理60 min，活性無(wú)明顯變化；100 ℃處理60 min，抑菌活性略有降低〔抑菌圈直徑為（25.16±0.28）mm〕。隨著溫度升高，VP4 細(xì)菌素的抑菌活性顯著降低；121 ℃處理60 min 后，抑菌圈直徑為20 mm，證明VP4 細(xì)菌素?zé)岱€(wěn)定性良好，可以耐受食品加工中最常見(jiàn)的巴氏殺菌操作（65～80 ℃加熱15 min），甚至在更高的滅菌溫度下（121 ℃，20 min）仍具有較高的活性，大大擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。

將發(fā)酵上清液調(diào)至不同pH 值，30 ℃孵育1 h后，檢測(cè)其抑菌活性，結(jié)果如表4所示。由表4可知，該抑菌物質(zhì)在pH 2～10 范圍內(nèi)抑菌效果穩(wěn)定；在pH 4.0 時(shí)，抑菌圈直徑最大為（30.85±0.41）mm；當(dāng)pH 值達(dá)到12 時(shí)，抑菌活性顯著下降。趙鈺[8]報(bào)道的凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素Lactocin LL1103，在pH 6.0 時(shí)具有最強(qiáng)的抑菌活性。而郭穎等[9]、張百剛等[10]報(bào)道的植物乳桿菌NDC75017細(xì)菌素、乳酸乳球菌細(xì)菌素Nisin，及大部分嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在pH 值為6 時(shí)，抑菌活性已完全喪失。李琳等[11]則發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌素ST9在pH 2.0～9.0 之間均有活性，還有一些細(xì)菌素只在堿性條件下才具有抑菌效果?？梢?jiàn)，菌種不同，細(xì)菌素發(fā)揮抑菌活性的最適pH 值不同，可能是由于pH 值的改變，影響到細(xì)菌素所帶的電荷或改變膜的組成，從而影響細(xì)菌素和靶細(xì)胞膜間的作用力[12]。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素抑菌試驗(yàn)的掃描電鏡觀察

由圖2可知，未經(jīng)處理的大腸桿菌形態(tài)規(guī)則完整，而經(jīng)濃縮5 倍的凝結(jié)芽孢桿菌VP4 發(fā)酵上清液處理24 h 的大腸桿菌菌體嚴(yán)重皺縮，內(nèi)容物泄露，菌體斷裂現(xiàn)象嚴(yán)重。未經(jīng)處理的金黃色葡萄球菌形態(tài)規(guī)則完整，表面較光滑，外觀飽滿，而經(jīng)濃縮5 倍的凝結(jié)芽孢桿菌VP4 發(fā)酵上清液處理24 h 的金黃色葡萄球菌菌體表面有明顯的凹陷、皺縮、內(nèi)容物流出，粘連現(xiàn)象嚴(yán)重。

表3 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性Table 3 Heat stability of bacteriocin produced by Bacillus coagulans VP4

表4 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素的pH 穩(wěn)定性Table 4 pH stability of bacteriocin produced by Bacillus coagulans VP4

2.5 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素在冷鮮羊肉保藏中的應(yīng)用

2.5.1 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素對(duì)冷鮮羊肉中微生物的影響 微生物在冷卻肉上繁殖，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物使肉呈腐敗氣味，這些異味物質(zhì)包括酯、含硫化合物（硫化氫、甲硫醚、甲硫醚的氧化產(chǎn)物等）、酮、支鏈醇、不飽和烴、氨或胺等是冷鮮肉腐敗變質(zhì)的主要原因[13]。周琰冰等[14]和孫丹丹等[15]采用傳統(tǒng)菌種分離手段結(jié)合PCR-DGGE 技術(shù)證明假單胞菌、嗜酸乳桿菌、清酒乳桿菌等乳酸菌、腸桿菌和其它一些嗜冷菌是4 ℃冷藏期間羊肉中的優(yōu)勢(shì)菌。

按照國(guó)標(biāo)GB/T 22289-2008[16]要求，新鮮肉的菌落總數(shù)＜4 lg（CFU/g）；次鮮肉為4～6 lg（CFU/g）；變質(zhì)肉為超過(guò)6 lg（CFU/g）。由圖3可知，本試驗(yàn)選取的羊肉都為新鮮羊肉，從0 d 開(kāi)始，細(xì)菌總數(shù)持續(xù)上升，對(duì)照組從第2 天開(kāi)始，菌落總數(shù)就超過(guò)了4 lg（CFU/g），而添加了VP4 細(xì)菌素的處理組羊肉中的細(xì)菌顯著受到抑制，并與劑量呈正相關(guān)，添加了8%VP4 細(xì)菌素的處理組在第7 天的細(xì)菌總數(shù)仍低于4 lg（CFU/g），在第15 天為5.12 lg（CFU/g），屬于次鮮肉。

腸桿菌屬于兼性厭氧菌，在有氧的環(huán)境下會(huì)分解葡萄糖，產(chǎn)生硫化物和胺類等有異味物質(zhì)，在無(wú)氧條件下會(huì)產(chǎn)生硫化氫。圖4結(jié)果顯示，添加了VP4 細(xì)菌素的處理組羊肉中的腸桿菌顯著受到抑制，4 ℃冷藏15 d 時(shí)，對(duì)照組、6%和8%VP4 細(xì)菌素處理組的腸桿菌數(shù)分別為7.98，6.82，5.02 lg（CFU/g）。

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素抑菌的電鏡試驗(yàn)Fig.2 SEM survey of antimicrobial activity of bacteriocin produced by Bacillus coagulans VP4

圖3 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化情況Fig.3 Changes of total viable counts in mutton samples during storage at 4 ℃

圖4 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中腸桿菌的變化情況Fig.4 Changes of Enterobacteria populations in mutton samples during storage at 4 ℃

乳酸菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，厭氧或兼性厭氧，是肉品中主要的腐敗菌。乳酸菌能夠利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸，當(dāng)碳水化合物耗盡，就開(kāi)始利用氨基酸產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，使肉品出現(xiàn)腐敗氣味，并且生長(zhǎng)速度會(huì)超過(guò)腸桿菌等其它腐敗菌，最終成為優(yōu)勢(shì)菌。在整個(gè)冷藏期間，乳酸菌的數(shù)量不斷上升，與對(duì)照組相比，添加6%VP4 細(xì)菌素處理組的冷鮮羊肉中的乳酸菌的數(shù)量下降了將近2 個(gè)數(shù)量級(jí)，并且6%和8%處理組之間沒(méi)有顯著差異。

假單胞菌為嗜冷菌，是低溫條件下肉品中的優(yōu)勢(shì)菌，其增殖速度快。在有氧環(huán)境下，假單胞菌會(huì)利用葡萄糖生長(zhǎng)繁殖；當(dāng)葡萄糖不再充足時(shí)，假單胞菌轉(zhuǎn)而利用氨基酸，會(huì)生成有異味物質(zhì)，如含硫化合物、氨、酯和酸類等腐敗產(chǎn)物。肉及肉制品、鮮魚(yú)貝類等食品被假單胞菌污染后會(huì)導(dǎo)致肉表面形成黏液，產(chǎn)生難聞的氣味，肉色變綠。本文采用8%VP4 細(xì)菌素的處理組在4 ℃冷藏15 d 時(shí)，假單胞菌的數(shù)量被控制在5 lg（CFU/g）以下，而對(duì)照組則上升到7.58 lg（CFU/g）。

圖5 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中乳酸菌的變化情況Fig.5 Changes of lactic acid bacteria populations in mutton samples during storage at 4 ℃

圖6 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中假單胞菌的變化情況Fig.6 Changes in Pseudomonas populations in mutton samples during storage at 4 ℃

2.5.2 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素對(duì)冷鮮羊肉理化指標(biāo)的影響 由于pH 值對(duì)酶的活性有一定影響，因此會(huì)影響酶催化降解產(chǎn)生核苷酸、游離氨基酸和小肽等風(fēng)味物質(zhì)，進(jìn)而影響肉的風(fēng)味。為了防止這種情況發(fā)生，可以通過(guò)檢測(cè)pH 值控制肉的品質(zhì)，從而降低經(jīng)濟(jì)損失[17]。一級(jí)鮮肉的pH 值指標(biāo)是5.9～6.5，次鮮肉的pH 值是6.6～6.7，腐敗變質(zhì)肉的pH＞6.7。如圖7所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中的pH 值呈逐漸升高趨勢(shì)，到第15 天時(shí)，對(duì)照組、6%和8%VP4 細(xì)菌素處理組的pH 值分別為7.51，6.25 和6.03，表明VP4 細(xì)菌素有效地抑制了冷藏肉中微生物的生長(zhǎng)，pH 值的升高主要是由于肉中的蛋白質(zhì)被分解成堿性的胺及胺類物質(zhì)，pH值越大，表明肉的腐敗程度越高。

15 d 內(nèi)，加入6%、8%VP4 細(xì)菌素的4 ℃保藏肉的電導(dǎo)率的變化規(guī)律如圖8所示。在細(xì)菌素的作用下，樣品中的微生物細(xì)胞降解破碎，細(xì)胞內(nèi)容物溢出，溶液中的離子增多，使電導(dǎo)率增大。

圖7 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中pH 的變化情況Fig.7 Changes in pH value of mutton samples during storage at 4 ℃

圖8 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中電導(dǎo)率的變化情況Fig.8 Changes in electric conductivity of mutton samples during storage at 4 ℃

TVB-N 值，即揮發(fā)性鹽基氮的含量，表示樣品中蛋白質(zhì)降解程度，是評(píng)價(jià)肉的新鮮程度的重要指標(biāo)，國(guó)標(biāo)GB/T 22289-2008[16]要求肉及肉制品中揮發(fā)性鹽基氮含量達(dá)15 mg/100 g 時(shí)，說(shuō)明肉已經(jīng)變質(zhì)腐敗。TVB-N 是貯藏期間，肉經(jīng)微生物或酶分解作用產(chǎn)生，主要包括氨、三甲胺（TMA）和二甲胺（DMA）等。羊肉在4 ℃冷藏期間的TVB-N 值變化如圖9所示，對(duì)照組中的TVB-N 值在第3 天時(shí)達(dá)到15.22 mg/100 g，已經(jīng)超過(guò)國(guó)標(biāo)限量值，而添加了VP4 細(xì)菌素的處理組在第10 天時(shí)，TVBN 值還未超過(guò)國(guó)標(biāo)限量值，大大延長(zhǎng)了冷鮮羊肉的保藏期。

TBA 指標(biāo)表明肉的脂肪氧化程度，很多研究結(jié)果表明，TBA 值的大小與肉品脂肪的氧化程度及感官評(píng)價(jià)之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。在國(guó)外，TBA 值常用于生肉鮮度的測(cè)定，當(dāng)TBA 值大于0.5 mg/kg時(shí)，表明氧化正在進(jìn)行。通常新鮮肉制品的最大TBA 值為0.71～1 mg/kg，超過(guò)即認(rèn)為是產(chǎn)生氧化酸敗，不能食用。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加VP4 細(xì)菌素的處理組在整個(gè)檢測(cè)期（15 d） 都未超出這個(gè)范圍，顯著抑制了肉的脂肪氧化酸?。坏?5 天時(shí)，對(duì)照組、6%和8%VP4 細(xì)菌素處理組的TBA 值分別為1.85，0.91，0.71 mg/kg。

圖9 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中TVB-N 的變化情況Fig.9 Changes in TVB-N of mutton samples during storage at 4 ℃

圖10 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中TBA 的變化情況Fig.10 Changes in TBA of mutton samples during storage at 4 ℃

肉品色澤是影響其銷售量的一個(gè)重要因素。肌肉自身的生理、生化以及微生物因素會(huì)影響肉品色澤，其中肌肉中肌紅蛋白和血紅蛋白的含量起到至關(guān)重要的作用，充分放血后肌紅蛋白對(duì)肉色起決定性作用，當(dāng)肉品中的肌紅蛋白被氧化后，會(huì)形成使肉色變暗的高鐵肌紅蛋白，降低肉的品質(zhì)[18]。色差L 值表示肉樣的明暗程度，數(shù)值越大，表明肉色越亮。由圖11可知，在4 ℃冷藏6 d 以內(nèi)，L 值變化不明顯；之后，對(duì)照組的L 值逐漸降低，而VP4 細(xì)菌素處理組減緩了L 值的下降，然而不同處理濃度組之間無(wú)顯著差異。云美林[4]利用生物抑菌涂膜法保藏冷鮮羊肉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組和對(duì)照組的L 值都呈降低趨勢(shì)。張黎利[19]采用植物精油抗菌包裝延長(zhǎng)冷鮮豬肉保藏期的研究發(fā)現(xiàn)，貯藏后期，肉的L 值下降，顏色較淺，缺乏光澤。Luo 等[20]利用分離自干火腿中的1 株唾液乳桿菌H（Lactobacillus salivarius H）對(duì)冷鮮豬肉色澤影響的研究報(bào)道也證實(shí)了這一點(diǎn)。

圖11 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中L 值的變化情況Fig.11 Changes in L value of mutton samples during storage at 4 ℃

圖12 冷鮮羊肉4 ℃貯藏過(guò)程中a 值的變化情況Fig.12 Changes in a value of mutton samples during storage at 4 ℃

肉樣表面色差指標(biāo)中，a 值表示紅度，a 值越大表明肉樣顏色越紅。由圖12可知，a 值在0 d時(shí)最高，表明剛開(kāi)始時(shí)羊肉色澤最紅，最鮮艷。之后，3 組a 值均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，與賀紅軍[21]、云美林[4]的結(jié)論類似。對(duì)照組和VP4 細(xì)菌素組在貯藏期間差異顯著，表明VP4 細(xì)菌素組對(duì)羊肉色澤的保持效果較好，紅度保持較穩(wěn)定。

2.5.3 凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素對(duì)冷鮮羊肉感官評(píng)價(jià)的影響 感官評(píng)價(jià)測(cè)定過(guò)程中，首先觀察肉制品的顏色是否均勻，貯藏期間肉品顏色由鮮紅逐漸變成暗紅，最后變成暗褐色；檢查切割處的顏色與光澤是否鮮艷，有無(wú)淤血、囊腫以及污染，還應(yīng)檢查肉邊是否有碎肉、碎骨等；之后聞其氣味是否新鮮，有無(wú)令人不愉悅的腥臭味；最后用手指按壓，接觸肉制品，判斷是否具有彈性或者發(fā)黏，做出綜合評(píng)價(jià)[16]。本文參考文獻(xiàn)[3]的方法，采用定量描述分析，對(duì)VP4 細(xì)菌素處理組和對(duì)照組中羊肉的色澤、質(zhì)地、氣味、黏性和汁液流失率5 項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)（每項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分為1～5 分，總分25 分）進(jìn)行感官分析，結(jié)果如圖13所示。VP4 細(xì)菌素處理組的感官評(píng)價(jià)明顯優(yōu)于對(duì)照組，表明凝結(jié)芽孢桿菌VP4 細(xì)菌素可以延長(zhǎng)冷藏羊肉的貨架期，提高產(chǎn)品品質(zhì)和安全性，具有優(yōu)良的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。

圖13 冷鮮豬肉4 ℃貯藏過(guò)程中的感官評(píng)價(jià)Fig.13 Sensory evaluation of mutton samples during storage at 4 ℃

3 結(jié)論

乳酸菌以其天然、強(qiáng)抗菌性及安全可靠等優(yōu)勢(shì)，逐步成為取代傳統(tǒng)食品保鮮技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)之一。本文從山西老陳醋醋醅中篩選出1 株具有強(qiáng)抑菌活性的凝結(jié)芽孢桿菌VP4，該菌產(chǎn)生的細(xì)菌素的pH 值和熱穩(wěn)定性較好。將VP4 細(xì)菌素應(yīng)用在冷鮮羊肉的保藏中，其抑菌效果明顯，顯示其作為生物保鮮劑在冷鮮肉保藏中的應(yīng)用潛力，為研究開(kāi)發(fā)新型食品保鮮技術(shù)提供依據(jù)。