王向陽，方勇剛，李 楠，任 煥，顧 雙，程周周

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018）

青菜是中國產(chǎn)量最大的蔬菜之一。采后青菜含水量高，呼吸代謝旺盛，在貯藏中容易失水萎蔫、黃化，還原型抗壞血酸（AsA）快速下降。青菜在10 ℃和20 ℃貯藏，黃化是貯藏主要限制因子，在2 ℃下萎蔫是主要問題[1]。3%O2能保持青菜較好的品質(zhì)，結(jié)合1-MCP 處理，保鮮效果更佳[2]。聚丙烯薄膜包裝能延長青菜的貨架期[3]。46 ℃熱水處理的青菜經(jīng)低溫貯藏，其貨架期較對照組延長了5 d，熱處理可以延緩葉綠素降解[4]。1-MCP 處理顯著延長了西蘭花的貨架期，而青菜的貨架期僅延長了10%～20%[5]。6-BA 處理可以減緩青菜的黃化、失重、呼吸強度，減少丙二醛（MDA）含量的上升，維持較高的總酚含量及DPPH 清除能力[6]。蔗糖浸泡青菜，顯著抑制了青菜的黃化[7]。

采后蔬菜品質(zhì)下降與自由基有關(guān)。果蔬組織有一套完整的活性氧清除系統(tǒng)[8]。主要有過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）等。外源膽固醇處理能提高高粱幼苗抗冷的能力[9]，提高膜保護(hù)酶的活性，保護(hù)葉綠體，增加細(xì)胞在低溫下膜的穩(wěn)定性和流動性[10]。豆甾醇能保持蘆筍的綠色，提高SOD、CAT 等活力，降低MDA 積累，延緩蘆筍貨架壽命[11]。膽固醇能阻止蘆筍葉綠素降解，抑制木質(zhì)化[12]，在體外溶液中能阻止葉綠素降解，在體內(nèi)抑制不飽和脂肪酸降解，延緩葉綠素結(jié)合蛋白分解，從而阻止葉綠素降解[13]。

心血管疾病常被認(rèn)為與血清膽固醇含量過高有關(guān)，而加拿大、韓國等國未把膽固醇作為膳食限量的成分[14-15]。2015年初發(fā)布的《美國居民膳食指南》取消了每日膳食膽固醇攝入的限量[16]。我國2016 版《中國居民膳食指南》也沒有膽固醇攝入限制。青菜是幼嫩葉菜，采后使用1-MCP 等抑制成熟的保鮮劑來阻止變色和AsA 下降效果有限。

本文采用膽固醇處理青菜，探討膽固醇處理對采后青菜品質(zhì)和體內(nèi)抗氧化代謝的影響。保鮮劑的消耗一般為蔬菜質(zhì)量的5%，保鮮后蔬菜膽固醇增量少，成本低。本研究旨在為今后使用富含膽固醇食物（例如：蛋黃中膽固醇含量為1 510 mg/100 g）處理采后蔬菜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要原料、試劑和儀器

青菜品種為“上海青”，來源于杭州郊區(qū)。每組處理20 張青菜葉片。

試劑：膽固醇、2，6-二氯酚靛酚、亞硝酸鈉，阿拉丁試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；還原型抗壞血酸，廣東光華科技股份有限公司；試劑盒，南京建成生物工程研究所。

主要儀器：2-16KL 高速冷凍離心機，美國SIGMA 公司；UV-2550 紫外分光光度計，日本SHIMADZU 公司。

1.2 處理方法

先用少量無水乙醇將膽固醇初步溶解（保證保鮮劑溶液中乙醇含量低于0.5%），再用去離子水定容，配制成0.0125，0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5 mmol/L 的膽固醇溶液，并用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.0，同時配制體積分?jǐn)?shù)0.6%的乙醇水溶液作為對照組。將青菜葉片去梗，沿中脈劈兩半，分別作為處理組和對照組，浸泡于膽固醇和對照組溶液中，浸泡2 h 后晾干，裝在開口聚乙烯袋中于2 ℃避光貯藏。經(jīng)感官評價，選取0.1 mmol/L濃度處理青菜。處理后貯藏于相對濕度（RH）95%，2 ℃的冷庫。分別測定貯藏0，7，14，21，28，35 d 青菜的失重率、可溶性固形物含量、葉綠素含量、丙二醛含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、還原型抗壞血酸含量、亞硝酸鈉含量及酶活性（APX、SOD、GR、CAT 和POD）。間隔取樣測定，重復(fù)測定3 次。

1.3 測定方法

1.3.1 失重率測定 采用稱量法。

失重率（%）=（貯藏前質(zhì)量-測定時質(zhì)量）/貯藏前質(zhì)量×100

1.3.2 可溶性固形物含量測定 取1.00 g 樣品，研磨后離心（4 000 r/min，10 min），取上清液，用阿貝折光儀測定。

1.3.3 葉綠素含量測定 采用Mampholo 等[3]方法。取0.20 g 樣品，加入20 mL 95%甲醇，于暗處常溫提取2 h，于4 ℃下9 558×g 離心10 min。取上清液測定OD646nm和OD662nm。

1.3.4 丙二醛含量測定 采用硫代巴比妥酸法。取1.00 g 樣品，加5.0 mL 100 g/L 三氯乙酸（TCA）溶液，研磨后于4 ℃下10 000×g 離心20 min，收集上清液。取2.0 mL 上清液（空白管用100 g/L TCA溶液代替），加入2.0 mL 0.67%TBA，混合后沸水浴20 min，冷卻后按上述條件離心。取上清液測定OD450nm、OD532nm和OD600nm。

1.3.5 可溶性蛋白質(zhì)含量測定 牛血清蛋白系列濃度，加入5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)G250 溶液。靜置2 min，測定OD595nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0056X+0.0128，R2=0.99976，式中，Y——OD 值；X——牛血清蛋白（μg）。樣品測定：取1.00 g 樣品，加入5 mL 蒸餾水，研磨后，4 ℃下12 000×g 離心20 min，取0.1 mL 上清液，稀釋至1.0 mL，添加上述考馬斯亮藍(lán)溶液比色。

1.3.6 還原型抗壞血酸含量測定 采用Ghasemnezhad 等[17]的方法測定。配制系列濃度AsA，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1.00 g 樣品加入少量20 g/L 草酸溶液，冰浴下研磨，用20 g/L 草酸溶液定容到100 mL。取10.0 mL，用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定。

1.3.7 亞硝酸鈉含量的測定 采用國標(biāo)GB 5009.3-2016[18]測定。系列亞硝酸鈉溶液加入2 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，靜置5 min，加入1 mL 2 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液，加水定容至50 mL，靜置15 min。測定OD538nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0091X-0.004，R2=0.9995。式中，Y——OD 值，X——亞硝酸鈉（μg）。樣品測定：取5.00 g 樣品，加入50 mL 蒸餾水，打漿40 s，50 mL 蒸餾水洗滌，加入少量活性炭，加熱15 min 脫色、過濾。按照國標(biāo)法反應(yīng)，測定OD538nm。

1.3.8 酶的提取和測定 取1.0 g 葉片，加5 mL提取液（pH 7.8，50 mmol/L PBS 緩沖液）冰浴研磨至勻漿狀，4 ℃下12 000×g，離心30 min，取上清液用于酶活性測定。參考試劑盒方法，所有酶采用試劑盒法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)，采用Excel 2010 和Origin 8.0 繪圖。顯著性分析采用t 檢驗。膽固醇處理引起青菜品質(zhì)和生理指標(biāo)變化之間的相關(guān)性分析：各種指標(biāo)變化率（%）=（處理組-對照組）/對照組，用Excel 2010 進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽固醇處理對采后青菜品質(zhì)的影響

人類飲食中超過90%的AsA 由水果和蔬菜提供[19]。由圖1可知，采后青菜AsA 迅速減少，采用膽固醇處理可顯著減少AsA 下降（P＜0.05）?？扇苄缘鞍踪|(zhì)既是營養(yǎng)和品質(zhì)指標(biāo)，也是生理生化指標(biāo)，其中含有多種參與生理生化代謝的酶[20]。青菜采后的可溶性蛋白質(zhì)含量持續(xù)大幅下降，膽固醇處理組的可溶性蛋白質(zhì)顯著高于對照組。采后青菜容易失水，膽固醇處理顯著降低了失水率，這可能與其脂溶性阻隔水分有關(guān)。人體攝入的硝酸鹽有80%～95%來自蔬菜，一些新鮮蔬菜中硝酸鹽的含量高達(dá)數(shù)千mg/kg FW[21]。蔬菜中硝酸鹽在貯藏和加工中因微生物、亞硝酸還原酶可能轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[22]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定腌漬蔬菜中亞硝酸鹽（NaNO2計）限量標(biāo)準(zhǔn)為≤20 mg/kg[23]。所檢測的青菜的亞硝酸鈉含量均低于國家標(biāo)準(zhǔn)限量。青菜冷藏14～21 d 會出現(xiàn)亞硝酸高峰，亞硝酸含量為0.45～0.52 mg/kg FW。膽固醇處理可推遲亞硝酸高峰1 周左右，也可降低亞硝酸含量。采后青菜的葉綠素含量迅速下降，膽固醇處理減少了葉綠素含量的下降?？扇苄怨绦挝镌谫A藏前期降幅很大，膽固醇處理顯著抑制其下降。

圖1 膽固醇處理對青菜品質(zhì)指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of cholesterol treatment on quality index of pak choy

2.2 膽固醇處理對采后青菜抗氧化酶和MDA 含量的影響

APX 是以抗壞血酸為電子供體的一種過氧化物酶。APX 能催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)，H2O2被分解清除。青菜采后APX 酶活性輕微下降。由圖2可知，膽固醇處理青菜的APX 酶活性在整個貯藏過程中顯著高于對照（P＜0.05）。SOD 能將O2-快速歧化為過氧化氫和分子氧，膽固醇處理阻止了前7 d SOD 活性下降，而標(biāo)準(zhǔn)誤差很大，影響了結(jié)果的可信度。GR 存在于植物的細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體等結(jié)構(gòu)中，在葉綠體中，GR酶活性占總抗氧化酶活性的50%～80%[24-25]。GR 可將氧化型谷胱甘肽還原成還原型谷胱甘肽，并與SOD、APX 相互作用，共同清除植物體內(nèi)多余的活性氧（ROS）[26]。青菜的GR 酶活性在整個冷藏過程中變化幅度較少，膽固醇處理的青菜GR 酶活性顯著高于對照（P＜0.05）。膽固醇處理也提高了青菜的CAT 酶活性。膽固醇處理減少了青菜MDA的含量，MDA 的減少，可能與膽固醇維持抗氧化酶較高活性有關(guān)。

2.3 膽固醇處理效果的相關(guān)性分析

膽固醇處理能很好的維持青菜的AsA，大幅度減少青菜失重，阻止亞硝酸鹽的產(chǎn)生。其中失重率和AsA 標(biāo)準(zhǔn)誤較小，說明膽固醇處理始終有促進(jìn)作用。亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)誤的差異很大，主要是膽固醇推遲其產(chǎn)生高峰時間所致。膽固醇對維持葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性固形物含量也有較好的作用。膽固醇對SOD、APX 酶有強烈的促進(jìn)作用，對GR、CAT 酶作用次之，對POD 幾乎無作用。從標(biāo)準(zhǔn)誤差來看，膽固醇在貯藏過程始終促進(jìn)APX、GR 酶活性，前期對SOD 酶活性的促進(jìn)作用較強。

圖2 膽固醇對青菜丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of cholesterol on MDA content and antioxidant enzymes activity of pak choy

表1 膽固醇對青菜品質(zhì)和抗氧化作用指標(biāo)的影響Table 1 Effect of cholesterol on quality and antioxidation indicators in pak choy

APX 主要功能是清除葉綠體中的H2O2，抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)主要依賴APX[27]。0.1 mmol/L膽固醇處理青菜后，AsA 的變化與APX 的變化相關(guān)系數(shù)最高（r=0.96；P＜0.01），其次為GR（r=0.45），其提供的還原型谷胱甘肽（GSH） 有助于保持AsA。SOD、CAT、POD 與AsA 相關(guān)性較低。膽固醇同時加強APX 活性和AsA 含量。APX 是消耗AsA的酶，膽固醇處理可能加強膜的區(qū)隔化，阻止APX氧化AsA。失水率、可溶性蛋白質(zhì)、MDA、SSC 與AsA 的相關(guān)系數(shù)分別為-0.88（P＜0.05），0.80（P＜0.05），-0.75（P＜0.05），0.51。失水率、可溶性蛋白質(zhì)與AsA 無明顯因果關(guān)系。MDA 是膜脂肪酸過氧化產(chǎn)物，AsA 是抗氧化劑，其下降會導(dǎo)致MDA 上升。SSC 含量下降，細(xì)胞會缺少能量，AsA 比例會下降。

GR 利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸），即NAD（P）將氧化型谷胱甘肽（GS-SG）催化成還原型谷胱甘肽（GSH），GSH 可以使氧化型抗壞血酸得到還原。膽固醇處理后GR 的變化與葉綠素的變化相關(guān)系數(shù)最高（r=0.90；P＜0.05），說明GSH 對于維持葉綠素含量較重要。

膽固醇處理后GR、CAT、SOD 的變化與亞硝酸鹽的變化有較高的負(fù)相關(guān)。采后青菜蛋白質(zhì)大量降解，氨基酸脫氨，導(dǎo)致氨氮上升。亞硝酸鹽是氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的中間物質(zhì)。該3 種抗氧化酶使細(xì)胞內(nèi)維持較好的還原狀態(tài)，從而減少氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。

膽固醇顯著提高蘆筍總抗氧化能力，抑制MDA 含量[28]。膽固醇處理后MDA 的變化與可溶性蛋白質(zhì)、SSC 的變化有較高的負(fù)相關(guān)，r 值均為-0.84（P＜0.05），然而與這2 種物質(zhì)沒有因果關(guān)系。膽固醇處理后MDA 的變化與APX、GR、POD的r 值分別為-0.55，-0.50，-0.48。說明提高該3種抗氧化酶活力，會減少膜脂肪的過氧化。SOD 和CAT 有很高的正相關(guān)（r=0.88，P＜0.05），可能膽固醇處理導(dǎo)致兩者同時加強。

表2 膽固醇處理對采后青菜各種指標(biāo)影響的相關(guān)性分析Table 2 The correlation analysis between the changes of indexes of pak choy caused by cholesterol treatment

3 結(jié)論

0.1 mmol/L 膽固醇處理能很好地阻止青菜在冷藏過程還原型抗壞血酸含量下降，減少失重率，阻止亞硝酸鹽含量上升。另外在青菜冷藏過程中，膽固醇處理可以阻止可溶性蛋白質(zhì)、葉綠素、可溶性固形物含量下降。膽固醇對采后青菜SOD 和APX 酶活力促進(jìn)作用最為顯著，對GR 和CAT 酶也有較好的促進(jìn)活力作用，而不影響POD 酶。膽固醇能穩(wěn)定地促進(jìn)青菜中APX、GR 酶活性。膽固醇處理后，AsA 與APX，葉綠素與GR 呈高度正相關(guān)。