張建旭，王旭旭，孫一丹，龔建剛，桑亞新，孫紀(jì)錄*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 承德市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 河北承德067000）

幾丁質(zhì)是僅次于纖維素的第二大天然多糖，是2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖和2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡聚糖由β-1，4-糖苷鍵連接而成，廣泛存在于甲殼類動(dòng)物殼中[1]。幾丁質(zhì)可以作為許多生物基材料的成分[2]。它在許多領(lǐng)域作為具有高潛力的新功能生物材料而受到極大關(guān)注[3]。

從甲殼類動(dòng)物殼中提取幾丁質(zhì)的傳統(tǒng)方法是分別使用鹽酸和氫氧化鈉去除殼中的礦物質(zhì)（主要為CaCO3）和蛋白質(zhì)，之后脫色。該方法雖然效率高，但是產(chǎn)生大量的酸堿廢液，造成環(huán)境問(wèn)題，增加生產(chǎn)成本[4]。電解水（Electrolyzed water，EW）是在特殊的裝置中電解稀氯化鈉溶液而得到的酸性電解水（Acidic electrolyzed water，AEW）和堿性電解水（Basic electrolyzed water，BEW）的總稱[5]。近年來(lái)，EW 在食品工業(yè)領(lǐng)域廣泛用于抗菌和保鮮[6-7]。利用EW 提取甲殼類動(dòng)物殼中的幾丁質(zhì)，迄今鮮有報(bào)道。

我國(guó)小龍蝦產(chǎn)量大，其可食部分少，蝦殼等廢棄物多，而蝦殼中富含幾丁質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室曾使用BEW 脫除蟹殼中的蛋白質(zhì)[8]。本研究擬在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別使用AEW 和BEW 對(duì)小龍蝦殼進(jìn)行脫礦物質(zhì)和脫蛋白質(zhì)研究，并分析幾丁質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，旨在為從蝦殼中提取幾丁質(zhì)開(kāi)發(fā)一種新型環(huán)保的生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 主要材料

蝦殼，保定市場(chǎng)售小龍蝦；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 主要儀器設(shè)備

電解水發(fā)生器，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制；752N 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；XL-100 型馬弗爐，河南市鶴壁億欣儀器儀表有限公司；WSC-2B 便攜式精密色差儀，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；SU8010 型掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；TG/DTAA6200 熱重分析儀，精工電子納米科技有限公司；Spectrum65 傅立葉紅外變換光譜儀，鉑金埃爾默儀器有限公司；XD6 多晶X 射線衍射儀，北京普析通用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蝦殼粉制備 清洗蝦殼，放入60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥器中，干燥至恒重。將烘干的蝦殼粉碎，過(guò)120 目篩，制得蝦殼粉，密封，干燥貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 EW 處理蝦殼粉

1） AEW 處理蝦殼粉 向電解水發(fā)生器的酸性、堿性電解槽中分別加入1 L 的NaCl 溶液，稱取20 g 蝦殼粉放入酸性電解槽中。接通電源進(jìn)行處理，電壓設(shè)為20 V。每隔0.5 h 測(cè)溶液pH 值及鈣離子含量，直至鈣離子含量趨向穩(wěn)定，停止電解，記錄處理時(shí)間。將處理液5 000 r/min 離心10 min，沉淀洗滌至中性，60 ℃干燥至恒重，即得脫去礦物質(zhì)的蝦殼粉。

2） BEW 處理蝦殼粉 操作過(guò)程與1.3.2（1）基本相同。其區(qū)別在于將蝦殼粉放入堿性電解槽中，處理期間測(cè)定處理液的pH 值及蛋白質(zhì)含量，所得為脫蛋白質(zhì)的蝦殼粉。

3） AEW 和BEW 聯(lián)合處理蝦殼粉 對(duì)蝦殼粉進(jìn)行AEW（2%NaCl 制備）處理脫礦物質(zhì)，操作過(guò)程與1.3.2（1）基本相同，將脫去礦物質(zhì)的蝦殼粉進(jìn)行BEW（2%NaCl 制備）處理脫蛋白質(zhì)，操作過(guò)程與1.3.2（2）基本相同，所得為幾丁質(zhì)。

1.3.3 傳統(tǒng)無(wú)機(jī)酸堿法制備幾丁質(zhì) 參考王娟娟[9]的方法。

1.3.4 鈣離子含量測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)GB 7476-1987《水質(zhì)鈣的測(cè)定EDTA 滴定法》[10]方法測(cè)定。

1.3.5 BEW 處理液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用紫外吸收法中的直接法[11]測(cè)定。

1.3.6 灰分測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》[12]方法測(cè)定。

1.3.7 固體樣品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定和蛋白質(zhì)脫除率的計(jì)算 參考韓曉梅等[8]的方法。

1.3.8 顏色測(cè)定 取不同EW 處理的粉末狀樣品約2 g，平鋪于稱量紙上，壓平，隨機(jī)選取3 個(gè)點(diǎn)用色差儀測(cè)量其L*、a*、b*值，以AEW 和BEW 聯(lián)合處理的樣品為對(duì)照，測(cè)定其它樣品的ΔL*、Δa*、Δb*及ΔE 值并進(jìn)行比較[13]。

1.3.9 水分含量測(cè)定 參照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》[14]方法測(cè)定。

1.3.10 特性黏度及黏均分子量的測(cè)定 黏均分子量測(cè)定參照Hong 等[15]和Poirier 等[16]的方法。選擇5%LiCl/DMAc 作為幾丁質(zhì)的溶劑，采用參數(shù)是α=0.95 和K=7.6×10-5dl/g。特性黏度測(cè)定參照蔣挺大[17]的方法，采用外推法計(jì)算特性黏度。

1.3.11 脫乙酰度測(cè)定 采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《甲殼素與殼聚糖》中附錄A 的方法[18]。

1.3.12 掃描電鏡觀察 將干燥樣品均勻地固定在貼膠的電鏡進(jìn)樣臺(tái)上，真空條件下離子濺射噴金，采用掃描電子顯微鏡拍照觀察樣品結(jié)構(gòu)。

1.3.13 熱重分析 參照《中華人民共和國(guó)藥典》第4 部0661 熱分析法中的熱重分析方法，設(shè)定升溫范圍30～600 ℃，升溫速率10 ℃/min[19]。

1.3.14 傅立葉變換紅外光譜分析 采用壓片法制備樣品，在Spectrum 65 傅立葉紅外變換光譜儀上掃描，掃描范圍4000～400 cm-1，掃描次數(shù)4次。

1.3.15 X 射線衍射分析 使用XD6 多晶X 射線衍射儀，掃描范圍為3°～60°，掃描速度8°/min。根據(jù)公式（1）計(jì)算結(jié)晶指數(shù)（CrI，%）。

式中，I100——2θ≌19°處的最大強(qiáng)度；Iam——2θ≌14°處的非晶衍射強(qiáng)度[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS Statistics 22 進(jìn)行誤差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AEW 對(duì)小龍蝦殼的脫礦物質(zhì)作用

在本研究的預(yù)試驗(yàn)中，考察了用0.1%和1%的NaCl 分別制備AEW，對(duì)蝦殼粉進(jìn)行處理。結(jié)果表明，用0.1%NaCl 制備的AEW 產(chǎn)酸量小而且緩慢，脫礦物質(zhì)作用很差；而采用1%NaCl 制備的AEW 產(chǎn)酸量提高，速度快，有明顯的脫礦物質(zhì)作用。因此，在本研究中，考察了1%和2%的NaCl 制備的AEW。

由圖1可知，2%NaCl 制備的AEW 處理液的pH 值從9.99 下降到1.98，然后趨于穩(wěn)定；1%NaCl制備的AEW 處理液的pH 值從9.99 下降到2.37后又上升到4.76，然后趨于穩(wěn)定，其原因可能與Cl-的耗盡有關(guān)。隨著電解時(shí)間的延長(zhǎng)，Cl-不斷轉(zhuǎn)化為Cl2，其中一部分散發(fā)于空氣中，一部分溶于水中，造成低pH 值；同時(shí)，蝦殼里的碳酸鈣會(huì)消耗H+，使pH 值上升。在本研究中，也曾嘗試進(jìn)一步提高NaCl 濃度，然而，在更高濃度下制備的AEW 對(duì)電解槽的離子交換膜損害很大，處理過(guò)程中經(jīng)常引起交換膜的穿孔滲漏。因此，本研究沒(méi)有使用更高濃度的NaCl。

由圖2可知，1%和2%NaCl 制備的AEW 處理液中的Ca2+濃度從起始的244 mg/L 分別增加到2 015 mg/L 和3 100 mg/L，并分別在330 min 和270 min 趨于穩(wěn)定，表明AEW 可有效脫除蝦殼粉中的CaCO3，制備AEW 的NaCl 濃度對(duì)CaCO3的脫除具有明顯影響。

圖1 AEW 處理期間pH 值的變化Fig.1 The pH value change during AEW treatment

圖2 AEW 處理期間Ca2+含量變化Fig.2 The change of calcium ion content during AEW treatment

由表1可知，經(jīng)1%NaCl 與2%NaCl 制備的AEW 處理的蝦殼粉，灰分分別從起始的53.10%下降到13.70%和0.77%，礦物質(zhì)脫除率分別達(dá)到86.08%和99.59%，表明AEW 對(duì)蝦殼粉具有強(qiáng)大的脫礦物質(zhì)作用，2%NaCl 比1%NaCl 制備的AEW 更為有效，這也驗(yàn)證了圖2的結(jié)果。

2.2 BEW 對(duì)小龍蝦殼的脫蛋白質(zhì)作用

由圖3可知，在BEW 處理蝦殼粉的過(guò)程中，1%與2%NaCl 制備的BEW 處理液的pH 值由10.07 分別上升至13.11 和13.70 左右，后者的pH值略高一些，這將更有利于蛋白質(zhì)的脫除。

由圖4可知，隨著電解時(shí)間的延長(zhǎng)，1%與2%NaCl 制備的BEW 處理液中的蛋白質(zhì)含量增加，表明發(fā)生了脫蛋白。1%NaCl 制備的BEW 處理液中蛋白質(zhì)濃度從90 min 開(kāi)始增加，在300 min 達(dá)到0.31 mg/mL，然后處于平穩(wěn)狀態(tài)；而2%NaCl 制備的BEW 處理液中蛋白質(zhì)濃度從0 min 就開(kāi)始增加，至240 min 時(shí)增加速度趨于恒定，表明更高的堿性環(huán)境（圖3） 更適于對(duì)蝦殼粉蛋白質(zhì)的脫除。

表1 AEW 處理后蝦殼中的灰分及礦物質(zhì)脫除率Table 1 Ash content and mineral removal rate of crawfish shell after AEW treatment

圖3 BEW 處理期間pH 值的變化Fig.3 The change of pH value during BEW treatment

圖4 BEW 處理期間蛋白質(zhì)含量的變化Fig.4 The change of protein content during BEW treatment

由表2可知，1%和2%NaCl 制備的BEW 處理后的蝦殼粉中蛋白質(zhì)含量分別由處理前的16.97%降至7.93%和2.16%，蛋白質(zhì)脫除率分別為65.53%和91.31%，表明BEW 能有效脫除蝦殼中的蛋白質(zhì)，后者的脫蛋白效果更好，這與圖4的結(jié)果基本一致。

表2 BEW 處理后小龍蝦殼中的蛋白質(zhì)及其脫除率Table 2 Protein content and its removal rate of crawfish shell after BEW treatment

2.3 AEW 和BEW 聯(lián)合處理小龍蝦殼制備幾丁質(zhì)

由圖5可知，2%NaCl 制備的BEW 處理液中蛋白質(zhì)的濃度在270 min 后不再上升，達(dá)到3.06 mg/mL，這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)AEW 處理后的蝦殼中的蛋白質(zhì)沒(méi)有了礦物質(zhì)的束縛，再經(jīng)BEW 處理時(shí)就較容易就被脫下。

圖5 聯(lián)合處理工藝中BEW 處理階段的蛋白質(zhì)含量的變化Fig.5 The change of protein content during BEW treatment of combination process

由表3可知，由2%NaCl 制備的AEW 和BEW 聯(lián)合處理后的蝦殼粉，礦物質(zhì)脫除率和蛋白質(zhì)脫除率分別達(dá)到99.65%和98.31%；灰分和蛋白質(zhì)含量分別為0.86%和1.31%，已經(jīng)符合幾丁質(zhì)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)；與傳統(tǒng)工藝相比，其脫除效率非常接近。因此，利用2%NaCl 制備的AEW 和BEW 聯(lián)合處理蝦殼粉，從中提取幾丁質(zhì)，可作為一種新的生產(chǎn)方法。其總處理時(shí)間確定為9 h，其中AEW 處理時(shí)間為270 min（圖2），BEW 處理時(shí)間也為270 min（圖5）。

表3 電解水處理工藝和傳統(tǒng)工藝的效率比較Table 3 Comparison of efficacy of EW treatment process and traditional process

2.4 EW 處理對(duì)小龍蝦殼的脫色作用

在本研究中，觀察到EW 處理除了能夠脫除蝦殼粉中的礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)，還有很好的脫色作用。

由圖6可知，AEW 處理蝦殼粉后，顏色變化明顯，表明脫色主要發(fā)生在AEW 處理過(guò)程中。這可能是因?yàn)橹苽銩EW 時(shí)生成的Cl2和ClO-具有漂白作用。這將省去傳統(tǒng)方法中的脫色過(guò)程。

從表4可知，在總色差方面，蝦殼粉較大，其次是傳統(tǒng)法處理的蝦殼粉，然后是BEW 處理的蝦殼粉，AEW 處理的樣品較小，而2%NaCl 制備的AEW 處理后的樣品色差值最小，進(jìn)一步證明脫色主要發(fā)生在AEW 處理中。

2.5 幾丁質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 一般理化性質(zhì) 脫乙酰度是區(qū)分幾丁質(zhì)與殼聚糖的主要參數(shù)，也是影響其物化性質(zhì)的主要原因[20]。分子質(zhì)量則直接決定了幾丁質(zhì)及其衍生物的黏度[17]，對(duì)幾丁質(zhì)的利用至關(guān)重要。

圖6 小龍蝦殼粉在不同處理后的顏色變化Fig.6 Changes in color of crawfish shell powder after different treatments

表4 不同處理后小龍蝦殼粉的色差值Table 4 Chromaticity values of crayfish shell powders after different treatments

表5 EW 處理工藝和傳統(tǒng)法制備的幾丁質(zhì)的一般理化性質(zhì)Table 5 Physicochemical properties of chitin prepared by EW treatment process and traditional method

由表5可知，傳統(tǒng)法和EW 處理工藝制備的幾丁質(zhì)的分子質(zhì)量和脫乙酰度分別為550，85 ku和27.36%，12.88%，后者具有較低的分子質(zhì)量和脫乙酰度。這可能是因?yàn)锳EW 中持續(xù)產(chǎn)生H+和ClO-，造成糖苷鍵的酸水解和氧化降解，從而產(chǎn)生低分子質(zhì)量的幾丁質(zhì)；傳統(tǒng)法中的高濃度NaOH溶液處理是發(fā)生脫乙?；闹饕?。因此，EW處理工藝生產(chǎn)的幾丁質(zhì)是一種新型的幾丁質(zhì)，有助于其應(yīng)用領(lǐng)域的拓展。

2.5.2 熱重分析和差熱分析 由圖7可知，3 種樣品的熱重分析（Thermogravimetric analysis，TGA）曲線變化趨勢(shì)大致相同。不同的是，EW 法制備的幾丁質(zhì)（圖7a） 和傳統(tǒng)法制備的幾丁質(zhì)（圖7b）的質(zhì)量隨溫度的變化曲線有較明顯梯度變化，質(zhì)量損失均為80%～90%，而小龍蝦殼粉（圖8c）的變化曲線較為平緩，質(zhì)量損失為35%～40%。這是因?yàn)槲r殼粉經(jīng)過(guò)脫礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)處理后剩下的幾丁質(zhì)組分單一，從而表現(xiàn)出晶體性質(zhì)；而蝦殼粉成分復(fù)雜，使得熱分解過(guò)程變化緩慢。3 種樣品的差熱分析（Differential thermal analysis，DTA）曲線的變化均隨其TGA 曲線的變化呈規(guī)律性，圖7a和7b 中均出現(xiàn)了凹點(diǎn)，這是短時(shí)間吸熱所致，對(duì)應(yīng)溫度是幾丁質(zhì)降解溫度，分別為382 ℃和389℃，表明EW 法制備的幾丁質(zhì)比傳統(tǒng)法制備的幾丁質(zhì)更易分解，這可能與前者的較低分子質(zhì)量有關(guān)。圖7c 中未明顯出現(xiàn)這樣的凹點(diǎn)。因此，EW 法與傳統(tǒng)法制備的幾丁質(zhì)有相似的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性。

2.5.3 掃描電鏡觀察 EW 法制備的幾丁質(zhì)纖維并排排列，略有散亂（圖8a）；傳統(tǒng)法制備的幾丁質(zhì)呈平滑多孔結(jié)構(gòu)（圖8b）；蝦殼粉呈現(xiàn)層狀堆積結(jié)構(gòu)，雖然也有一些細(xì)孔狀結(jié)構(gòu)，但更像是由纖維鑲嵌粘連雜質(zhì)組成的實(shí)體（圖8c）。無(wú)論是EW 法還是傳統(tǒng)法，從小龍蝦殼中提取的幾丁質(zhì)均呈網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，這在吸附染料和金屬離子等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值[21-22]。

2.5.4 傅里葉變換-紅外光譜 圖9A 和9B 都出現(xiàn)幾丁質(zhì)的特征吸收峰，一系列窄吸收峰帶表現(xiàn)出典型的結(jié)晶多糖譜帶。1 660 cm-1和1 626 cm-1兩個(gè)吸收峰是α-幾丁質(zhì)在酰胺Ⅰ譜帶（C=O）的特征吸收峰，表明2 種方法提取的幾丁質(zhì)均為α-幾丁質(zhì)；1 558 cm-1處的吸收峰屬于酰胺Ⅱ譜帶（NH）；1 313 cm-1處的吸收峰屬于酰胺Ⅲ譜帶（CN）。對(duì)比圖9A、9B 和9C，EW 法與傳統(tǒng)法制備的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相似，而蝦殼粉在3 種酰胺帶上均未出現(xiàn)明顯吸收峰，這是因?yàn)槲r殼粉中的雜質(zhì)影響了幾丁質(zhì)的特定吸收峰。

圖7 熱重分析和差熱分析曲線Fig.7 TGA/DTA curves

2.5.5 X-射線衍射 圖10A 和10B 反映出幾丁質(zhì)顯著的結(jié)晶信號(hào)，純度再次得到驗(yàn)證。圖10C 有CaCO3的衍射峰，圖10A 和10B 都無(wú)CaCO3的峰，同樣表明2 種方法都脫除了CaCO3。EW 法和傳統(tǒng)法制備的幾丁質(zhì)的結(jié)晶度指數(shù)分別為82.48%和78.82%，都遠(yuǎn)高于蝦殼粉的45.78%。另外，EW 法制備的幾丁質(zhì)的結(jié)晶度指數(shù)略高于傳統(tǒng)法，這與兩者分子質(zhì)量差異導(dǎo)致分子間和分子內(nèi)氫鍵不同以及無(wú)定形態(tài)幾丁質(zhì)生成有關(guān)[23]。

圖8 掃描電鏡圖（×5 000）Fig.8 SEM（×5 000）

圖9 傅里葉變換-紅外光譜Fig.9 FT-IR spectra

圖10 X-射線衍射圖譜Fig.10 XRD patterns

3 結(jié)論

本文試驗(yàn)結(jié)果表明，AEW 能夠有效脫除小龍蝦殼中的礦物質(zhì)，并具有良好脫色作用。BEW 能夠有效脫除小龍蝦殼中的蛋白質(zhì)。脫除效果與用于制備EW 的NaCl 濃度有關(guān)。以2%NaCl 制備的AEW 和BEW 先后對(duì)小龍蝦殼連續(xù)處理各270 min，制得符合標(biāo)準(zhǔn)要求的幾丁質(zhì)。與傳統(tǒng)酸堿法相比，EW 處理工藝制備的幾丁質(zhì)具有較低的特性黏度、分子質(zhì)量和脫乙酰度。TGA、TDA、SEM、FT-IR 和XRD 的結(jié)果表明，2 種方法制備的幾丁質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)具有很高的相似性，也直觀證實(shí)了礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的脫除。因此，EW 處理工藝是一種用小龍蝦殼制備幾丁質(zhì)的新方法。