朱 敏， 趙麗敏， 王 培， 肖亞麗

［河南省人民醫(yī)院（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院）呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南鄭州450003］

哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞組分及神經(jīng)遞質(zhì)參與的氣道慢性非特異性炎癥［1］。過往研究發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病機(jī)制與輔助性T 細(xì)胞（helper T-cell，Th）1 和Th2 的異常分化與功能異常引起的繼發(fā)性的炎癥因子表達(dá)增多和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制失調(diào)密切相關(guān)［2］。目前，支氣管哮喘的治療以抗炎、藥物改善癥狀和免疫治療為基本治療方法［3］。

異鼠李素（isorhamnetin，Iso）主要來源于胡頹子科植物沙棘的果實(shí)和銀杏提取的黃酮類化合物，也是槲皮素的直接代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素有內(nèi)皮保護(hù)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌缺血、降血壓、抗血栓及血小板凝集、抗氧化等多種心腦血管保護(hù)作用，同時(shí)具有抑制脂肪細(xì)胞分化、抗腫瘤、降糖、抗炎和抗病毒等多種作用［4-5］。但是目前關(guān)于異鼠李素在哮喘中作用的研究還比較少，本實(shí)驗(yàn)通過卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘發(fā)小鼠哮喘模型，研究異鼠李素對(duì)哮喘小鼠肺炎癥的作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

32 只 6～7 周齡 SPF 級(jí)雄性 BALB/c 小鼠（20.5±2.1）g 由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房，所有小鼠自由飲水飲食。動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（豫）2017-0001。

異鼠李素（純度：99%）購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；OVA 購于 Sigma；HE 和 PAS 染色試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司；半胱氨酰白三烯1（cysteinyl leukotriene 1，CysLT1）、半胱氨酰白三烯受體1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-13 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA試劑盒均購自上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司；抗活化T 細(xì)胞核因子4（nuclear factor of activated T cells 4，NFATc4）抗體、抗細(xì)胞間黏附分子 1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）抗體、抗血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）抗體和 GAPDH 均購自 Thermo Fisher Scientific。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的制備及藥物處理 32 只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（control 組）、哮喘模型組（OVA組）、異鼠李素低劑量（50 mg/kg）處理組（OVA+50 mg/kg Iso 組）和異鼠李素高劑量（150 mg/kg）處理組（OVA+150 mg/kg Iso 組），每組各8 只。采用OVA致敏并用OVA 激發(fā)的方法制備哮喘小鼠模型，除正常對(duì)照組外，其余組小鼠在實(shí)驗(yàn)第1 天和第7 天分別腹腔注射OVA 抗原液0.2 mL 致敏，在第15 天開始將小鼠置于密閉透明容器內(nèi)給予10 g/L OVA霧化，每天30 min，連續(xù)激發(fā)刺激2 周；正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水霧化。異鼠李素處理于實(shí)驗(yàn)第15 天起在霧化前30 min 分別腹腔注射異鼠李素50 mg/kg 和150 mg/kg，模型組和正常對(duì)照組采用相同容積的生理鹽水腹腔注射。在最后一次OVA 霧化24 h 后，用3%戊巴比妥鈉（1 mL）腹腔注射處死動(dòng)物。

2.2 支氣管肺泡灌洗 小鼠處死后，仰臥位固定，經(jīng)氣管插管，用生理鹽水緩慢灌洗左肺6 次，每次5 mL，收集灌洗液后，4 ℃下1 500 r/min 離心10 min 后取上清液，在-20 ℃冰箱保存。

2.3 組織病理學(xué)檢測(cè) 解剖小鼠取出右肺下小葉，用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，分別行HE和PAS染色，觀察肺部組織的病理學(xué)改變。

2.4 ELISA 檢測(cè)支氣管肺泡灌注液（broncho-alveolar lavage fluid，BALF）中的細(xì)胞因子 參照ELISA試劑盒說明，分別檢測(cè) BALF 中 CysLT1、CysLTR1、IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α的含量。

2.5 免疫組織化學(xué)染色 制備5 μm 肺組織石蠟切片，免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)NFATc4的表達(dá)，在400倍顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 Western blot 檢測(cè)蛋白水平 取右肺組織100 mg 放入試管，剪碎，加入裂解液裂解1 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液后用Bio-Rad蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度，分別取50 μg 蛋白樣本經(jīng)SDSPAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，加Ⅰ抗（包含抗 ICAM-1、VCAM-1 和NFATc4抗體，稀釋比例為1∶1 000）于37 ℃搖床上孵育2.5 h，PBST洗滌后，加Ⅱ抗（1∶1 000）于37 ℃搖床上孵育0.5 h。PBST 洗滌后用ECL 發(fā)光顯影，以GAPDH 為內(nèi)參照，用Bio-Rad 凝膠成像分析儀檢測(cè)染色條帶強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化

HE 和PAS 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠支氣管、小動(dòng)脈及肺泡結(jié)構(gòu)清晰，支氣管上皮細(xì)胞排列整齊，無血腫和炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠支氣管上皮細(xì)胞增厚，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管周圍充血；異鼠李素高、低劑量組肺組織炎癥較模型組減輕，鏡下可見炎癥細(xì)胞浸潤減少，充血水腫改善，見圖1。

Figure 1.Pathological changes of mouse lung tissues by HE staining and PAS staining.The scale bar=50 μm.圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化

2 CysLT1和CysLTR1水平的檢測(cè)

與正常對(duì)照組相比，模型組BALF 中CysLT1 和CysLTR1 含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，異鼠李素低、高劑量組CysLT1 和CysLTR1 含量均顯著減少（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The levels of CysLT1 and CysLTR1 in BALF of each group analyzed by ELISA.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OVA group.圖2 各組BALF中CysLT1和CysLTR1水平

3 IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α在BALF中的含量

與正常對(duì)照組相比，模型組BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 和TNF-α 含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，異鼠李素低、高劑量組BALF 中IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α含量均顯著減少（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The levels of IL-4，IL-5，IL-13 and TNF-α in BALF analyzed by ELISA.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OVA group.圖3 各組BALF中IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α水平的變化

4 異鼠李素抑制OVA 激活的calcineurin/NFATc4通路

與正常對(duì)照組相比，模型組NFATc4、ICAM-1 和VCAM-1 蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，異鼠李素低、高劑量組NFATc4、ICAM-1 和VCAM-1蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），見圖4。

討 論

哮喘的發(fā)病機(jī)制與Th1/Th2 細(xì)胞的異常分化以及調(diào)控比例失衡有關(guān)［6-7］。由Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如 IL-4、IL-5 和 IL-13 等，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞大量聚集，從而輔助B 細(xì)胞產(chǎn)生IgE，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)［8］。半胱氨酸白三烯（cysteinyl leukotrienes，CysLTs）通過其受體 CysLTR1 可促使嗜酸性粒細(xì)胞聚集，促進(jìn)氣道黏液分泌、支氣管收縮和增加氣體交換障礙，最終引起氣道重塑，是哮喘發(fā)病過程中最重要的炎癥介質(zhì)之一［9-10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘模型組 IL-4、IL-5、IL-13、CysLT1 和 CysLTR1表達(dá)顯著高于正常組，說明哮喘小鼠Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)亢進(jìn)，異鼠李素治療顯著降低哮喘小鼠IL-4、IL-5、IL-13、CysLT1 和CysLTR1 的表達(dá)，表明異鼠李素可以顯著抑制哮喘中Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，改變Th1/Th2 細(xì)胞平衡，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。

Figure 4.The expression of calcineurin-NFATc4 signaling pathway-related proteins in lung tissues of each group.A：NFATc4 positive cells in various groups by immunohistochemistry detection（the scale bar=50 μm）；B：the results of Western blot for determining the protein expression of ICAM-1，VCAM-1 and NFATc4 in the lung tissues.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OVA group.圖4 各組肺組織中calcineurin-NFATc4信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

血管內(nèi)皮異常是哮喘過程中炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，calcineurin/NFATc4 是血管內(nèi)皮細(xì)胞異常激活和炎癥反應(yīng)的重要通路［11-13］。哮喘發(fā)病過程中會(huì)有大量的 TNF-α 產(chǎn)生［14］，過往研究發(fā)現(xiàn) TNF-α 可誘導(dǎo)NFATc4 向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而使得ICAM-1 和VCAM-1 在血管內(nèi)皮上的表達(dá)顯著增加［15］。本實(shí)驗(yàn)中，哮喘模型組TNF-α、NFATc4、ICAM-1 和VCAM-1表達(dá)顯著高于正常組，異鼠李素治療顯著降低哮喘小鼠 TNF-α、NFATc4、ICAM-1 和 VCAM-1 表達(dá)，表明異鼠李素可能是通過calcineurin/NFATc4 通路來抑制哮喘小鼠的肺炎癥反應(yīng)的。

綜上所述，本研究通過異鼠李素治療OVA 誘發(fā)的哮喘模型小鼠，證明其可以抑制哮喘小鼠肺炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制calcineurin/NFATc4 通路活化有關(guān)。